一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu制造技术

本发明专利技术公开了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu，在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用，其中美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的制备方法包括pMD18‑T‑EF‑Tu重组载体的构建、质粒pET32a‑EF‑Tu的构建、美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的诱导表达和美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的验证。本发明专利技术提供了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu，利用原核表达系统对其表达和纯化，通过动物实验评估该美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的免疫保护力，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础。

An Extracellular Protein EF-Tu of Luminescent Bacillus Mermaid

The invention discloses an extracellular protein EF Tu of Luminescent Bacillus Mermaid with immune protection and its application in the preparation of Luminescent Bacillus Mermaid subunit vaccine. The preparation method of the extracellular protein EF Tu of Luminescent Bacillus Mermaid includes the construction of pMD18 T EF Tu recombinant vector, the construction of plasmid pET329;a EF Tu, and the induction of Luminescent Bacillus Mermaid extracellular protein EF Tu. Expression and validation of the extracellular protein EF Tu of Luminescent Bacillus mermaid. The invention provides an extracellular protein EF Tu of Luminescent Bacillus Mermaid with immune protection function, expresses and purifies it by prokaryotic expression system, evaluates the immune protection of the extracellular protein EF Tu of Luminescent Bacillus Mermaid through animal experiments, and lays a foundation for further development of Luminescent Bacillus Mermai subunit vaccine and selection of nucleic acid vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu。
技术介绍
美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)是嗜盐病原菌中的重要成员，患病鱼临床以出血性败血症为典型特征，发病迅速，死亡率高，能够造成海洋经济鱼类养殖业的重大经济损失。同时，美人鱼发光杆菌能够感染人和哺乳动物，具有一定的公共卫生学意义。前期研究发现美人鱼发光杆菌能够向菌体外分泌大量胞外产物，且具有良好的免疫保护作用，而转录起始因子Tu(elongationfactorTu，EF-Tu)是胞外产物的重要成分，那美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu是否具有良好的免疫保护作用则有待验证。疫苗是控制传染病流行的重要手段,目前针对美人鱼发光杆菌感染疫苗研究仍处于初步阶段，此外该菌疫苗的开发存在难以克服的问题，一方面灭活疫苗免疫效率低下，免疫效果差强人意；另一方面，基因工程减毒疫苗虽免疫效果优良，但安全问题不容忽视。因此，对美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu进行制备，并对美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的免疫保护作用进行验证，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，利用原核表达系统对其表达和纯化，通过动物实验评估该美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的免疫保护力，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用。一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的制备方法包括以下步骤：1)pMD18-T-EF-Tu重组载体的构建根据EF-Tu的基因序列设计引物如下：EF-Tu-F：5'-GCGGATCCATGTCTAAAGAAAAATTTGAACG-3'，BamHⅠ；SEQIDNO：1；EF-Tu-R：5'-GCGTCGACTTAAGCGATGATTGTAGCAAC-3'，SalI，SEQIDNO：2；以美人鱼发光杆菌EF-Tu的基因序列为模板，EF-Tu-F和EF-Tu-F为引物，PCR扩增EF-Tu目的基因，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-EF-Tu，并对所述pMD18-T-EF-Tu进行测序比对；2)质粒pET32a-EF-Tu的构建利用限制性内切酶BamHⅠ和SalI分别对pMD18-T-EF-Tu载体和pET-32a载体进行双酶切，构建重组表达载体pET32a-EF-Tu；3)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的诱导表达将重组载体pET32a-EF-Tu转入表达菌株中，挑取单克隆进行诱导表达美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；4)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的验证将所述美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu进行Westernblot检测验证。进一步的，步骤1)中所述PCR扩增方法配制50μL反应体系：TaqDNA聚合酶1.0μL，PCRBuffer5μL，DNA模板1.0μL，dNTPs4μL，引物EF-Tu-F和EF-Tu-F各1.0μL，ddH2O37μL；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；52℃退火30s；72℃延伸1min；72℃总延伸5min。进一步的，步骤2)中所述质粒pET32a-EF-Tu构建的具体过程为：经所述限制性内切酶酶切后回收目的条带，将所述pET-32a载体与所述pMD18-T-EF-Tu载体3:1混合，22-25℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞中，涂布Amp平板，37℃培养过夜；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，并将阳性菌落扩大培养，提取质粒pET32a-EF-Tu。进一步的，步骤3)所述表达菌株为BL21，挑取单克隆菌落利用液体LB培养基进行培养，直至OD600值达到0.6时，加入浓度为1mM的IPTG诱导表达4-6h，收集菌体。进一步的，步骤3)所述液体LB培养基中含100μg/mL的Amp；其中，所述单克隆菌落的具体培养方法为：将所述单克隆菌落在所述液体LB培养基中培养过夜，次日吸取菌液与所述液体LB培养基按照1:100的体积比进行混合，200-300rpm摇菌培养，直至OD600值达到0.6。本专利技术公开提供了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，至少有以下优点：(1)本专利技术公开的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu够被美人鱼发光杆菌阳性血清所识别，且在美人鱼发光杆菌自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，即美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu具有较好的免疫保护力。(2)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu能够使机体产生较高水平特异性抗体，效价能够达到38400，具有较好的抗原性。(3)本专利技术公开的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu免疫小鼠后能够使80％的免疫小鼠得到保护，具有良好的免疫保护力，美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在美人鱼发光杆菌疫苗研究中具有广阔的前景，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术提供的EF-Tu基因扩增电泳图；图2附图为本专利技术提供的诱导表达的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu电泳图；其中，泳道M为Marker；泳道1为美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；泳道2为空载体对照；图3附图为本专利技术提供的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的westernblot验证；其中，泳道1为美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；泳道2为空载体对照；图4附图为本专利技术提供的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的表达形式分析图；其中，M为预染蛋白Maker；泳道1为全菌；泳道2为包涵体；泳道3为上清；图5附图为本专利技术提供的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的纯化电泳图；其中，泳道M为Marker；泳道1为纯化前美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；泳道2为纯化后美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1pMD18-T-EF-Tu重组载体的构建下载PhotobacteriumdamselaeATCC3359(ACCESSIONNUMBER：NZ_CP018297)全基因组，根据EF-Tu的基因序列，设计引物如下：EF-Tu-F：5'-GCGGATCCATGTCTAAAGAAAAATTTGAACG-3'，BamHⅠ；SEQIDNO：1；EF-Tu-R：5'-GCGTCGACTTAAGCGATGATTGTAGCAAC-3'，SalI，SEQIDNO：2；提取PhotobacteriumdamselaeATCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu，在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用。2.一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)pMD18-T-EF-Tu重组载体的构建根据EF-Tu的基因序列设计引物如下：EF-Tu-F：5'-GCGGATCCATGTCTAAAGAAAAATTTGAACG-3'，BamHⅠ；SEQIDNO：1；EF-Tu-R：5'-GCGTCGACTTAAGCGATGATTGTAGCAAC-3'，SalI，SEQIDNO：2；以美人鱼发光杆菌EF-Tu的基因序列为模板，EF-Tu-F和EF-Tu-F为引物，PCR扩增EF-Tu目的基因，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-EF-Tu，并对所述pMD18-T-EF-Tu进行测序比对；2)质粒pET32a-EF-Tu的构建利用限制性内切酶BamHⅠ和SalI分别对pMD18-T-EF-Tu载体和pET-32a载体进行双酶切，构建重组表达载体pET32a-EF-Tu；3)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的诱导表达将重组载体pET32a-EF-Tu转入表达菌株中，挑取单克隆进行诱导表达美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；4)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的验证将所述美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu进行Westernblot检测验证。3.根据权利要求2所述的一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述PCR扩增方法为配制5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴同垒，史秋梅，张志强，于秀剑，杜万年，高桂生，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北,13