胡椒碱用于制备抗肿瘤药物的用途制造技术

可靶向作用于APJ受体的中药单体胡椒碱。它能够抑制人肝癌SMMC‑7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。胡椒碱在新靶点的发现以及治疗肿瘤方面的用途。

Application of Piperine in the Preparation of Antineoplastic Drugs

Piperine, a traditional Chinese medicine monomer targeting APJ receptor, can be used as a target. It can inhibit the proliferation of human hepatocellular carcinoma SMMC 7721 cells, human cervical cancer HeLa cells, human breast cancer MDA MB 231 cells and human lung adenocarcinoma A549 cells, and has the strongest inhibitory effect on human cervical cancer HeLa cells. The discovery of new targets and the use of piperine in the treatment of tumors.

【技术实现步骤摘要】
胡椒碱用于制备抗肿瘤药物的用途
本专利技术涉及中药单体胡椒碱新靶点的发现以及抗肿瘤的功能和用途。
技术介绍
1993年O’Dowd等利用同源性克隆的方法发现了一种血管紧张素II1型受体相关蛋白，命名为APJ(AGTRL-1,APLNR)，是G蛋白偶联受体(Gproteincoupledreceptor，GPCR)家族成员。人APJ基因APLNR定位在11号染色体的q12区域，编码380个氨基酸残基组成的受体。APJ主要分布于肺部、心脏、肾脏、中枢神经系统和脂肪等组织，参与机体多种病理生理过程，包括炎症反应、血管生成、维持心肌收缩力、调节体液平衡等以及参与心血管疾病、肿瘤和代谢性疾病的发生发展，在多种疾病中发挥着重要作用，已经被证实成为一种新的多疾病治疗潜在靶点。目前发现有2种内源性配体(Apelin,ELABELA)可以激活APJ受体。到目前为止，虽然有越来越多的APJ先导化合物报道，但仍然没有研发出用于临床APJ受体药物。本实验室采用细胞膜色谱技术筛选出能与APJ结合的中药单体——胡椒碱。并利用DiscoveryStudio2.5软件，对胡椒碱进行类药性分析，结果显示，胡椒碱均具有ADME性质，属于类药性分子。胡椒碱是一种从胡椒属植物中提取的生物碱，是中国和印度常用的食品与传统药物之一，胡椒碱已被证实具有广泛的药理活性，包括抗惊厥，抗氧化，抗炎，保肝，抗菌和免疫调节。而对于它的作用靶点以及对人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞这四种肿瘤细胞增殖的抑制作用，是没有被发现的。
技术实现思路
本申请的专利技术人经过多年的研究，意外地发现了中药单体胡椒碱可以结合APJ受体，并发现具有抗肿瘤的新功能。胡椒碱可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。根据本专利技术的一个方面，提供胡椒碱用于制备药物的用途，其中该药物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。该药物用于抑制和治疗人宫颈癌HeLa细胞增殖、人肝癌SMMC-7721细胞增殖、人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、人肺腺癌A549细胞增殖所引起的肿瘤。根据本专利技术的另一个方面，提供一种抗肿瘤药物组合物，它包含胡椒碱。该药物组合物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。中药单体胡椒碱可靶向作用于APJ受体。本申请还公开了所述胡椒碱在治疗肿瘤的基础研究和药物研究中的应用。本专利技术涉及胡椒碱抗肿瘤新功能的发现及其相关机制的发现。本专利技术通过使用细胞膜色谱技术筛选出能与APJ受体结合的中药单体--胡椒碱，并发现其可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。本专利技术公开了所述胡椒碱在治疗肿瘤的基础研究和药物研究中的应用。本专利技术的药物的体外实验：优选浓度为：本专利技术的有益技术效果1、本专利技术的胡椒碱能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。2、本专利技术的胡椒碱能够用于制备抗肿瘤药物组合物。3、本专利技术的胡椒碱的新靶点(APJ受体)能够用于制备该靶点的结合剂或靶向药物。附图说明：图1-5为构建重组质粒pEGFP-N1-APJ的检测结果；图1为PCR扩增APJ基因片段电泳图；M为MarkerDL2000，泳道1为PCR扩增的APJ基因；图2为APJ和pEGFP-N1双酶切电泳图；M为MarkerDL2000，泳道1为双酶切后的APJ，泳道2为双酶切后的载体pEGFP-N1；图3为重组质粒pEGFP-N1-APJ电泳图；M1为MarkerDL5000，泳道1-12为重组质粒，M2为MarkerDL2000。图4为重组质粒pEGFP-N1-APJ碱基序列；图5为重组质粒pEGFP-N1-APJ序列比对；图6-10为稳定转染重组质粒的检索结果；图6为转染细胞筛选GFP荧光拍照图；A为转染空载体pEGFP-N1的细胞，B为转染重组质粒pEGFP-N1-APJ的细胞；图7为转染细胞总RNA电泳图；M为MarkerDL2000，泳道1-5为细胞APJ-HEK293,泳道6为转染空载的pEGFP-N1-HEK293细胞；图8为RT-PCR溶解曲线(APJTm＝84℃，GAPDHTm＝90℃)；图9为APJ-HEK293细胞中APJmRNA表达(n＝6,**p<0.01APJ-HEK293vspEGFP-N1-HEK293,control组为HEK293细胞组)；图10为APJ-HEK293细胞中APJ蛋白表达水平(A：WesternBlot条带图，B：灰度扫描统计图；n＝3,**p<0.01APJ-HEK293vspEGFP-N1-HEK293)；图11为16种中药单体在APJ-HEK-293/CMC和HEK-293/CMC中的保留时间；图12为胡椒碱在APJ-HEK-293/CMC和HEK-293/CMC的色谱图(RT胡椒碱＝13.67min)；图13为胡椒碱抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)；图14为胡椒碱抑制人肺腺癌A549细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)；图15为胡椒碱抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)；图16为胡椒碱抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)。具体实施方式筛选能与APJ受体结合的中药单体胡椒碱并检测其功能，如下实施例所示。以下实施用于说明本专利技术，但不可用来限制本专利技术的范围。实施例1筛选能与APJ结合的中药单体细胞膜色谱技术利用药物与细胞膜受体结合时的特异性亲和力，将高效液相色谱、细胞生物学、分子生物学、生物化学和受体药理学结合，将药物在体内的作用在色谱柱上进行动态模拟。通过将活性细胞膜固定在固定载体表面，制备成细胞膜固定相(CMSP)，以缓冲溶液为流动相，用色谱分析的方法研究药物或化合物与固定相上细胞膜或细胞膜受体间的相互作用。1.构建重组质粒pEGFP-N1-APJ人源APJ基因片段为1143bp。以目的基因片段为模板进行PCR特异性扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到分子量为1100bp左右的目的条件，与APJcDNA大小符合。载体pEGFP-N1是一种分子量为4733bp的真核表达载体，有多个克隆位点，方便目的基因的插入。用限制性内切酶HindIII和XhoI对pEGFP-N1和PCR扩增得到的APJ目的基因分别进行双酶切(37℃，4h)，分别得到分子量大小为4700bp和1100bp的目的条带。在将载体pEGFP-N1和APJ进行连接(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.胡椒碱用于制备药物的用途，其中该药物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。

【技术特征摘要】
2017.07.11 CN 20171056282031.胡椒碱用于制备药物的用途，其中该药物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。2.根据权利要求1所述的用途，其中该药物用于治疗人宫颈癌HeLa细胞增殖、人肝癌SMM...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兰芳，陈临溪，李瑶，张涛，韩省力，王嗣岑，傅念，吕德官，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43