用于检验嗜碱性细胞活化的方法技术

诊断过敏反应的方法，其包括以下步骤：a)在全血的存在下，在水溶液中，使患者全血样品中的嗜碱性细胞与过敏原接触，其中全血与水溶液的体积比为至少20体积％，条件是使所述嗜碱性细胞允许被所述过敏原活化，b)富集获自步骤a)的嗜碱性细胞并c)检验活化的嗜碱性细胞，其中所述检验经此实现，即借助化学发光法检测活化嗜碱性细胞的表征性标志物的表达；本发明专利技术还涉及试剂盒，其包含用于使嗜碱性细胞与过敏原接触的容器(其中所述容器优选是微滴定板)、任选的过敏原、借助化学发光法检测活化嗜碱性细胞的表征性标志物的试剂(其中优选为针对标志物的配有能化学发光的标记的配体且所述配体更优选是单克隆抗体)、任选的用于终止所述嗜碱性细胞活化的试剂、任选结合到不依赖于嗜碱性细胞活化状态位于嗜碱性细胞表面的多肽上的可固定化的配体(其中所述配体优选是针对所述多肽的单克隆抗体)、和任选的用于胞溶和/或去除红细胞的试剂。

Method for testing basophil activation

The method for diagnosing anaphylaxis includes the following steps: (a) in the presence of whole blood, in aqueous solution, contacting the basophilic cells in the whole blood sample of the patient with allergens, in which the volume ratio of whole blood to aqueous solution is at least 20 volumes, provided that the basophilic cells are allowed to be activated by the allergens, and (b) enriched from the basophilic cells of step a) and (c) testing the activated basophilic cells. The detection of alkaline cells is accomplished by detecting the expression of characterization markers of activated basophilic cells by chemiluminescence method, and the invention also relates to a kit comprising containers for contacting basophilic cells with allergens (in which the container is preferably a microtitration plate), an optional allergen, and characterization of activated basophilic cells by chemiluminescence method. Reagents for markers (preferably ligands with chemiluminescent markers for markers and preferably monoclonal antibodies), an optional reagent for terminating the basophilic cell activation, and an optional Immobilizable ligand bound to a polypeptide located on the surface of basophilic cells independent of the basophilic cell activation state (the ligand preferred is for the basophilic cell surface). Monoclonal antibodies to the polypeptide, and optional reagents for cytolysis and/or removal of red blood cells.

【技术实现步骤摘要】
用于检验嗜碱性细胞活化的方法本专利技术涉及用于诊断过敏反应的方法，其包括以下步骤：a)在全血的存在下，在水溶液中，使患者全血样品中的嗜碱性细胞与过敏原接触，其中全血与水溶液的体积比为至少20体积％，条件是使所述嗜碱性细胞允许被所述过敏原活化，b)富集获自步骤a)的嗜碱性细胞并c)检验活化的嗜碱性细胞，其中所述检验经此实现，即借助化学发光法检测活化嗜碱性细胞的表征性标志物；本专利技术还涉及试剂盒，其包含用于使嗜碱性细胞与过敏原接触的容器(其中所述容器优选是微滴定板)、任选的过敏原、借助化学发光法检测活化嗜碱性细胞的表征性标志物的试剂(其中优选为针对标志物的配有能化学发光的标记的配体且所述配体更优选是单克隆抗体)、任选的用于终止所述嗜碱性细胞活化的试剂、任选结合到不依赖于嗜碱性细胞活化状态位于嗜碱性细胞表面的多肽上的可固定化的配体(其中所述配体优选是针对所述多肽的单克隆抗体)、和任选的用于胞溶和/或去除红细胞的试剂。用于速发型过敏(也称为I型过敏，其基于IgE介导的免疫应答)的诊断，根据详细的既往史首先进行皮试如皮肤点刺测试或诱发测试，这对于过敏诊断学是金标准。作为补充,使用体外测试，用其检验针对一种或多种经定义的过敏原的特异性IgE-抗体的存在。对于这种检验，将过敏原结合到如小海绵、膜或小球的基质上并与患者血清接触。随即借助经标记的抗-人-IgE抗体测定经结合的IgE的量。体外特异性IgE-测定的优点包括其便利的可操作性、可标准化特性(Standardisierbarkeit)和可规模化性(Aufskalierbarkeit)。然而，通常不能区分临床相关的过敏和只是敏感。其它缺点是某些过敏原的不良可支配性和由于过敏原偶合基质而使过敏原构型可能变化，这可改变过敏原对待检验的IgE-抗体的亲和性。在很多情况下，过敏原提取物仅艰难地被标准化或根本不能被标准化。较小的过敏原还必须结合到载体分子如血清白蛋白上。此外，对于血清中的IgE-抗体与在效应细胞如嗜碱性细胞和肥大细胞上的膜结合的IgE-抗体的过敏原特异性不必一致，因为溶解的和结合的IgE仅缓慢地发生交换。最后，不能在用于检验特异性IgE-抗体的体外测试中反映的额外因素，确定是否确实诱发了细胞性过敏反应，所述因素例如在血液中总IgE与特异性IgE的总量比或抗体的亲和性。特别是当IgE测试和皮试提供不明确的结果时，就此值得推荐的是，作为补充，采用细胞测试系统如嗜碱性细胞-脱粒测试或嗜碱性细胞-活化测试(BAT)。通常，与流式细胞测量法-测试相关地使用术语“BAT”。细胞测试相比于仅测定在血清中溶解的、未生物活化的IgE-部分的特异性IgE-抗体测定的特别优点是，其确实地反映细胞生物学反应，其通过过敏原在嗜碱性细胞的细胞表面上的受体结合的IgE-抗体上的结合及其横向交联(Quervernetzung)诱发。所述细胞测试还允许测定脱粒能力的阈值。对此特别需要用于治疗进程监控的免疫治疗。原则上，细胞测试以如下方式进行，首先使患者血液与过敏原接触。如果患者之前已经过敏了(sensibilisiert)，则发生了过敏原在位于嗜碱性细胞表面的受体结合的过敏原特异性IgE-抗体上的结合。这导致IgE-受体的交联(Kreuzvernetzung)，其继而诱发嗜碱性粒细胞的脱粒和由此从细胞内颗粒释放介质(Mediatoren)。这些介质，例如组胺、白细胞三烯和类胰蛋白酶，可借助于在上清液中的酶免疫分析进行量化。所述介质的溢出(Ausschüttung)伴随着在细胞表面上标志物如CD63或CD203c浓度的提高，所述标志物之前位于细胞内颗粒的膜上并由此同样显示细胞反应。所述介质的溢出由此显示对所述过敏原的细胞反应。至今在常规诊断学中，借助针对活化特异性的细胞表面标志物的与荧光团偶合的抗体，流式细胞测量法地检验这种加强的表面浓度。就此，待检验的细胞在液体射流中逐一流过薄的测量室并通过多个不同波长的激光射线，在此针对每种细胞类型产生表征性散射光并同时(只要存在活化的细胞)取决于激发抗体结合的荧光团的相应波长。由激发的荧光团发射的光且所述散射光被检测器捕获。这种测试系统的缺点是流式细胞测量仪的高设备成本，测试结果的复杂性，所述测试结果只能由特别培训的技术人员解读，以及困难的可标准化性质。此外，一直只可以用仪器同时测量一种样品。本专利技术进一步关注的问题涉及样品质量，其包括可活化的嗜碱性细胞。样品质量和由此其用于诊断方法的适宜度取决于，是否专业地进行获取、运输和储存。例如样品暴露于热或者不适宜的缓冲剂可导致细胞的凋亡。如果质量不合格，会导致错误的阴性结果，即阴性结果不是由患者没有过敏导致的，而是由患者样品的质量不合格导致的，根本没有或包含过少的可活化的嗜碱性细胞。如果在进行耗费的方法如流式细胞测量法时才确定样品质量的不合格，则这是特别低效的。因此需要一种方法和可用于该方法的反应剂，有效(即在对于高通量适宜的方法中)确定样品的质量。这种方法虽然不使用过敏原进行并且因此不提供诊断有用的结果，但允许预言样品质量对于分开批次(Ansatz)实施的诊断方法是否是适宜的。这种方法可在所述诊断方法之前、之后或平行实施。这种方法或其中所使用的反应剂可用于测定细胞配制物中可活化的嗜碱性细胞(优选样品)的数量或含量。DE10235310公开了一种测试，其中借助于荧光钙染料检验嗜碱性细胞的活化。其使用通过密度梯度离心分级的血液。WO2012/044756、US2009/0246805、WO98/32014和EP2037269公开流式细胞测量法的测试用于检验嗜碱性细胞的活化。出于这些背景，本专利技术的根本任务在于提供一种方法和对于该方法适宜的反应剂，用其能够克服在现有技术所描述的方法中的上述缺点，特别是可用不同于流式细胞测量仪的其它系统进行的嗜碱性细胞的活化测试。特别是任务在于创造一种系统，其允许以高通量方法同时处理多个样品。此外确保可再现性和可标准化。该任务和其它任务通过本专利技术的主题特别是通过随附独立权利要求的主题完成，其中优选的实施形式由从属权利要求给出。在第一方面，通过用于诊断过敏的方法解决本专利技术的根本问题，所述方法优选是对于高通量适宜的方法，其包括以下步骤：a)在全血的存在下，在水溶液中，使患者全血样品中的嗜碱性细胞与过敏原接触，其中全血与水溶液的体积比为至少20体积％，条件是使所述嗜碱性细胞允许被所述过敏原活化，b)富集获自步骤a)的嗜碱性细胞并且c)检验活化的嗜碱性细胞，其中在步骤c)中的检验经此实现，即借助化学发光法检测活化嗜碱性细胞的表征性标志物。在第一方面中的所述问题可替代地通过包括以下步骤的诊断方法解决：a)在全血的存在下，在水溶液中，使患者全血样品中的嗜碱性细胞与过敏原接触，其中全血与水溶液的体积比为至少20体积％，条件是使所述嗜碱性细胞允许被所述过敏原活化，b)富集获自步骤a)的嗜碱性细胞并且c)检验活化的嗜碱性细胞，其中在步骤c)中的所述检验经此实现，即借助化学发光法检测位于嗜碱性细胞表面上的标志物，其中在步骤b)中经此富集嗜碱性细胞，即所述嗜碱性细胞结合到配体上，所述配体特异性结合到多肽上，所述多肽是对于活化的嗜碱性细胞的表征性标志物，和/或在步骤c)中的所述检验经此实现，即借助化学本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于诊断过敏的方法，其包括以下步骤：a)在全血的存在下，在水溶液中，使患者全血样品中的嗜碱性细胞与过敏原接触，其中全血与水溶液的体积比为至少20体积％，条件是使所述嗜碱性细胞允许被所述过敏原活化，b)富集获自步骤a)的嗜碱性细胞并c)检验活化的嗜碱性细胞，其中在步骤c)中的检验经此实现，即借助化学发光法检测位于嗜碱性细胞表面的嗜碱性细胞标志物，其中在步骤b)中嗜碱性细胞经此富集，即所述嗜碱性细胞结合到配体上，所述配体特异性结合到多肽上，所述多肽是对于活化的嗜碱性细胞的表征性标志物，和/或在步骤c)中的所述检验经此实现，即借助化学发光法检测活化嗜碱性细胞的表征性标志物。

【技术特征摘要】
2017.08.08 EP 17001352.8;2017.12.05 EP 17001979.81.用于诊断过敏的方法，其包括以下步骤：a)在全血的存在下，在水溶液中，使患者全血样品中的嗜碱性细胞与过敏原接触，其中全血与水溶液的体积比为至少20体积％，条件是使所述嗜碱性细胞允许被所述过敏原活化，b)富集获自步骤a)的嗜碱性细胞并c)检验活化的嗜碱性细胞，其中在步骤c)中的检验经此实现，即借助化学发光法检测位于嗜碱性细胞表面的嗜碱性细胞标志物，其中在步骤b)中嗜碱性细胞经此富集，即所述嗜碱性细胞结合到配体上，所述配体特异性结合到多肽上，所述多肽是对于活化的嗜碱性细胞的表征性标志物，和/或在步骤c)中的所述检验经此实现，即借助化学发光法检测活化嗜碱性细胞的表征性标志物。2.根据权利要求1的方法，其中所述全血是未经处理的全血。3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤a)在具有30、优选35、更优选40、更优选45体积％全血份额的水溶液中进行。4.根据权利要求1至3任一项的方法，其包括终止嗜碱性细胞活化的步骤，优选在步骤b)之前。5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中在步骤b)中所述嗜碱性细胞经此富集，即所述嗜碱性细胞结合到配体上，所述配体特异性结合到多肽上，所述多肽优选不取决于嗜碱性细胞的活化状态位于嗜碱性细胞的表面。6.根据权利要求5的方法，其中所述配体是针对所述多肽的单克隆抗体。7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中在步骤b)中所述嗜碱性细胞被固定化。8.根据权利要求7的方法，其中所述嗜碱性细胞被固定化在小珠上，优选小磁珠。9.根据权利要求7至8任一项的方法，其中在固定化后洗涤所述嗜碱性细胞。10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中在步骤b)中红细胞被胞溶和去除。11.根据权利要求10的方法，其中在嗜碱性细胞的固定化之前通过离心去除红细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·格鲁恩，H·希斯曼，A·维曼，
申请(专利权)人：欧蒙医学诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE