The invention discloses a method for detecting Escherichia coli based on magnetic graphene oxide composite Venus@gold-silver alloy nanoparticles, which belongs to the technical field of food safety detection. Firstly, graphene oxide nanomaterials and 4 ATP labeled Venus @ Au Ag Raman substrate materials were prepared, and the nucleic acid adapters of target bacteria were modified on their surfaces. When the target bacteria existed, Venus @ Au Ag alloy nanoparticles were immobilized on the magnetic graphene oxide nanomaterials through the combination of surface nucleic acid adapters and target bacteria. Unfixed Venus@Au-Ag alloy nanoparticles were removed by magnetic separation. The linear relationship between the concentration of pathogenic bacteria and the Raman signal intensity of 4 ATP was established by Raman spectrometer scanning, and the quantitative detection of E. coli was realized. The invention realizes rapid and highly sensitive detection of pathogenic microorganisms. The invention provides an effective method for rapid detection of harmful microorganisms in food and environment.
【技术实现步骤摘要】
一种基于磁氧化石墨烯复合金星@金-银合金纳米颗粒对大肠杆菌进行检测的方法
本专利技术涉及一种基于磁氧化石墨烯复合金星@金-银合金纳米颗粒对大肠杆菌进行检测的方法，属于食品安全检测
技术介绍
大肠杆菌等食源性致病菌能够在食品加工生产过程中污染食品，引起食物变质的同时能够分泌有毒物质，引发出血性肠炎、溶血性尿毒综合征、败血症等疾病，尤其是对于抵抗力较弱的儿童甚至会导致死亡。由于这种感染具有潜伏期短、来势凶猛、短时多人同时发病等特点，极易导致大规模食源性疾病的爆发。建立和研究食源性病原菌快速检测方法，对于保障食品安全和人类健康具有十分重要的意义。在食源性病原菌的检测中，时间和灵敏度是最重要的两项指标，因为微生物生长旺、繁殖快，食物中甚至一个病原菌都有可能引发感染，这就要求在最短时间内对病原菌进行准确痕量检测。传统病原菌的检测方法多采用细菌分离培养法，该方法虽具有较好的稳定性，但因其复杂费时(一般需3-5天)、工作量大、需要丰富的经验基础等，已远远不能满足当前食品安全快速检测的需求。近年来，针对食源性病原菌，人们开发了许多新型快速检测方法，如酶联免疫测定法、PC...
【技术保护点】
1.一种基于磁氧化石墨烯复合金星@金‑银合金纳米颗粒对大肠杆菌进行检测的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：1)磁氧化石墨烯纳米材料制备：分别称取硫酸铁铵、硫酸亚铁铵，在N2的保护条件下，加入温度为50～90℃的超纯水中，用氢氧化铵调节pH为3‑5，随后加入氧化石墨烯溶液，调节pH值为至9‑11，搅拌冷却至室温，用无水乙醇与超纯水分别交替清洗，冷冻干燥后得到磁氧化石墨烯纳米材料；2)4‑ATP标记的金星@金‑银合金纳米颗粒制备：取制备的4‑ATP标记的金星@银纳米颗粒溶液，向其中加入氯金酸溶液、磷酸缓冲盐溶液、聚乙烯吡咯烷酮溶液和盐酸羟胺溶液，混合均匀，得到4‑ATP标记...
【技术特征摘要】
1.一种基于磁氧化石墨烯复合金星@金-银合金纳米颗粒对大肠杆菌进行检测的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：1)磁氧化石墨烯纳米材料制备：分别称取硫酸铁铵、硫酸亚铁铵，在N2的保护条件下，加入温度为50～90℃的超纯水中，用氢氧化铵调节pH为3-5，随后加入氧化石墨烯溶液，调节pH值为至9-11，搅拌冷却至室温，用无水乙醇与超纯水分别交替清洗，冷冻干燥后得到磁氧化石墨烯纳米材料；2)4-ATP标记的金星@金-银合金纳米颗粒制备：取制备的4-ATP标记的金星@银纳米颗粒溶液，向其中加入氯金酸溶液、磷酸缓冲盐溶液、聚乙烯吡咯烷酮溶液和盐酸羟胺溶液，混合均匀，得到4-ATP标记的金星@金-银合金纳米颗粒溶液；3)纳米材料表面修饰核酸适配体：取步骤1)和步骤2)制备的磁氧化石墨烯纳米材料和金星@金-银合金纳米颗粒，分别向两种纳米材料中加入大肠杆菌核酸适配体溶液，反应过夜后，磁分离或离心去上清，分别得到核酸适配体修饰的磁氧化石墨烯和金星@金-银合金纳米颗粒；4)大肠杆菌拉曼检测体系标准曲线建立：将步骤3)制备的核酸适配体修饰的磁氧化石墨烯和金星@金-银合金纳米颗粒混合，向其中加入不同浓度的目标菌液，当有目标菌存在时，4-ATP标记的金星@金-银合金纳米颗粒通过结合目标菌被固定在磁氧化石墨烯表面，通过外加磁场将磁氧化石墨烯纳米材料富集到磁场一边，未固定的金星@金-银合金纳米颗粒保留在上清液中，去除上清液，加少量无菌水重悬沉淀；对重悬液采用拉曼光谱进行扫描，建立细菌浓度与4-ATP拉曼信号线性关系，计算最低检测限；5)食品样本大肠杆菌检测：从超市购买合格的生鲜奶，向样品中加入不同浓度的大肠杆菌菌液，混匀后向其中加入磁氧化石墨烯纳米材料及金星@金-银合金纳米颗粒混合溶液，通过外加磁场将磁氧化石墨烯纳米材料富集到磁场一边，没有固定的金星@金-银合金纳米颗粒保留在上清液中，去除上清液，加少量无菌水重悬沉淀；对重悬液进行拉曼光谱测定，将扫描峰的强度代入标准曲线，定量计算食品样品中目标菌的数量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：硫酸铁铵与硫酸亚铁铵的摩尔比为1～3：1；氧化石墨烯溶液的浓度为0.5～1.5mg/mL，硫酸铁铵：超纯水与氧化石墨烯溶液的质量比为(0.5～1.5)g:(180～220)g：(30～60)mg。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中4-ATP标记的金星@银纳米颗粒溶液的制备方法如下：第一步：金星纳米颗粒表面修饰拉曼信标分子：向金星纳米颗粒溶液中加入的4-氨基苯硫酚溶液，搅拌均匀，离心去上清液，加入超纯水重悬，得到摩尔浓度为1～30nmol/L的拉曼信标分子标记的金星纳米颗粒溶液；第二步：金星@银纳米颗粒：将步骤(1)制备的拉曼信标分子标记的金星纳米颗粒溶液与聚乙烯吡咯烷酮溶液、抗坏血酸溶液与磷酸缓冲盐溶液混合均匀，随后加入硝酸银溶液，用氢氧化钠调节溶液至碱性，搅拌10～60min，反应结束离心去上清，加超纯水，制备得到浓度为1～20nmol/L的拉曼信标分子标记的金星@银纳米颗粒溶液。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：第一步中：金星纳米颗粒溶液的浓度为1～15nmol/L，4-氨基苯硫酚溶液的浓度为0.1～5mmol/L；优选：金星纳米颗粒溶液的浓度为3～10nmol/L，4-氨基苯硫酚溶液的浓度为0.1～3mmol/L；进一步优选：金星纳米颗粒溶液与4-氨基苯硫酚溶液的体积比为100：1～10；最优选：金星纳米颗粒溶液与4-氨基苯硫酚溶液的体积比为100：3～8；第二步中：磷酸缓冲盐溶液的浓度为5～20mmol/L；聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量浓度为0.1～5％；抗坏血酸溶液的摩尔浓度为50～150mmol/L；硝酸银溶液的摩尔浓度为1～15mmol/L；优选：第二步中：磷酸缓冲盐溶液的浓度为8～15mmol/L；聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量浓度为0.1～3％；抗坏血酸溶液的摩尔浓度为80～120mmol/L；硝酸银溶液的摩尔浓度为3～8mmol/L；进一步优选：第二步中：拉曼信标分子标记的金星纳米颗粒溶液：磷酸缓冲盐溶液：聚乙烯吡咯烷酮溶液：抗坏血酸溶液：硝酸银溶液的体积比为1～10：10～30：5～15：1～10：1～5；最优选：第二步中：拉曼信标分...
【专利技术属性】
技术研发人员：严文静，章建浩，王红霞，戈永慧，李艾潼，李芮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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