本发明专利技术属于农业生物技术领域，具体涉及葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用。发明专利技术公开了一种来源于嗜热蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM 12802的新的酸性葡萄糖淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的葡萄糖淀粉酶具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。本发明专利技术还公开该葡萄糖淀粉酶的制备方法，根据本发明专利技术的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良、适合工业应用的葡萄糖淀粉酶。
Glucose Amylase TlGA1931 and Its Genes and Applications
The invention belongs to the field of agricultural biotechnology, in particular to glucoamylase TlGA1931 and its gene and application. A new acidic glucose amylase derived from thermophilic cyanobacteria Talaromyces leycettanus JCM 12802 is invented and disclosed. Its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.2. The glucose amylase of the invention has good properties and can be used in feed, food, medicine and other industries. The invention also discloses the preparation method of the glucose amylase, and according to the technical scheme of the invention, the glucose amylase with good quality and suitable for industrial application can be produced by means of genetic engineering.
【技术实现步骤摘要】
葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用。
技术介绍
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，作用于淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，生成糊精和低聚糖。β-淀粉酶为外切酶，它从淀粉非还原性顺次切下麦芽糖。而葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1,4糖苷键的外切酶，其系统名称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶(α-1,4-glucanglucohydrolase,EC.3.2.1.3)或γ-淀粉酶(γ-amylase)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶从非还原糖末端切下葡萄糖分子。葡萄糖淀粉酶底物专一性较低，即能够切断α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键也有轻微的水解能力。葡萄糖淀粉酶是工业上用量最大的生物酶制剂之一，其可用于将淀粉酶水解产物转化为葡萄糖，进而葡萄糖再转化为工业产品，因此，被广泛地应用于食品、医药和发酵等工业。葡萄糖淀粉酶在微生物中分布很广，现有技术中已存在来源于细菌、真菌和酵母的多种葡糖淀粉酶被报道，具体来源包括曲霉属、根霉属、腐质霉属、毛菌以及青霉属等。这些酶的最适温度一般为55-60℃，最适pH为3.5-5.0。而在实际的工业应用中，淀粉液化的温度通常在95℃条件下进行，现有糖化酶的最适温度与实际需要相去甚远，以致淀粉酶在高温下水解无法达到预期的效果。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的葡萄糖淀粉酶的最适温度较低的问题，本专利技术提供一种葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用。本专利技术的目的在于提供一种葡萄糖淀粉酶TlGA1931。本专利技术的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931。本专利技术的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组表达载体。本专利技术的再一目的在于提供包含葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组菌株。本专利技术的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶TlGA1931的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供葡萄糖淀粉酶TlGA1931的应用。根据本专利技术具体实施方式葡萄糖淀粉酶TlGA1931，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：其中，该酶全长613个氨基酸，N端20个氨基酸为信号肽序列“MQYLLKTTLGALSVAQLVIA”。因此，成熟的葡萄糖淀粉酶TlGA1931的理论分子量为63.3kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：本专利技术还提供了编码上述葡萄糖淀粉酶TlGA1931的基因，该酶的全基因序列如SEQIDNO.3所示：本专利技术的葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931结构基因全长1990bp，含有4个内含子，+240～293bp、+582～640bp、+737～786、+1428～1524为其内含子序列，cDNA长1824bp，其cDNA序列如SEQIDNO.4所示：其中，信号肽的碱基序列为：“ATGCAGTACCTTCTTAAAACTACCCTCGGCGCTCTGAGCGTTGCTCAGCTTGTCATCGCG”。因此，成熟基因的编码序列如SEQIDNO.5所示：本专利技术还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组载体，优选为pPIC9-Tlga1931。将本专利技术的葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖淀粉酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Tlga1931。本专利技术还提供了包含上述葡萄糖淀粉酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/1931。本专利技术还提供了一种制备葡萄糖淀粉酶TlGA1931的方法，包括以下步骤：(1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖淀粉酶TlGA1931的表达；以及(3)回收并纯化所表达的葡萄糖淀粉酶。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichicpastoris)GS115，得到重组菌株GS115/1931。本专利技术的葡萄糖淀粉酶TlGA1931属于糖基水解酶第15家族，其最适pH为5.0，在pH2.0-10.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力；其最适温度位65℃，在55℃下处理60min，酶活仍能保持79％，在60℃下处理60min，依然能够保持55％的酶活力，具有较好的温度稳定性。本专利技术提供了上述葡萄糖淀粉酶TlGA1931的应用，运用基因工程手段来产业化生产葡萄糖淀粉酶。本专利技术还提供了一个新的葡萄糖淀粉酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本专利技术的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良、适合工业应用的葡萄糖淀粉酶。附图说明图1显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的最适pH；图2显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的pH稳定性情况；图3显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的最适温度；图4显示葡萄糖淀粉酶TlGA1931的温度稳定性情况。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：毕赤酵母(PichiapastorisGS115)、毕赤酵母表达载体pPIC9；2、培养基：(1)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH4)SO4，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.2g/LCaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min(2)LB培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl。(3)YPD培养基：2％葡萄糖、1％酵母提取物、2％蛋白胨。(4)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，13.4％YNB，0.000049<Biotin，0.5％甘油(v/v)。(5)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同。实施例1葡萄糖淀粉酶编码基因Tlga1931的克隆1.葡萄糖淀粉酶的基因组DNA以嗜热蓝状菌TalaromycesleycettanusJCM12802总DNA为模板进行PCR扩增，引物如表1所示，PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,50℃30sec,72℃2min,30个循环，72℃10min。得到一约1800bp片段，将该片段回收后测序，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。表1基因克隆本实验所需的引物2.葡萄糖淀粉酶cDNA的获得提取TalaromycesleycettanusJCM12802的总RNA，利用Oligo(dT)20和反转录酶得到cDNA的一条链，然后利用表1所示的引物1931F和1931R，扩增该单链cDNA，获得葡萄糖淀粉酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后测序，得到葡萄本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.葡萄糖淀粉酶TlGA1931，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.葡萄糖淀粉酶TlGA1931，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931，其特征在于，编码权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶TlGA1931。3.根据权利要求2所述的葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。4.包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组表达载体。5.包含权利要求2所述葡萄糖淀粉酶基因Tlga1931的重组表达载体pPIC9-...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗会颖，姚斌，彤丽格，涂涛，黄火清，王苑，苏小运，王亚茹，柏映国，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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