一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法。本发明专利技术所述生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所述细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂，因此，本发明专利技术所述玻璃化冷冻试剂能够在避免细胞内形成冰晶同时，还极大地降低冷冻保护剂对细胞的毒性，提升细胞的存活率，保障细胞的正常发育。

A vitrification refrigeration reagent, kit and its application method for reproductive refrigeration

The invention relates to a vitrification refrigeration reagent, a kit for reproductive refrigeration and a method for its use. The vitrification cryoprotectant for reproductive freezing comprises intracellular vitrification cryoprotectant, which comprises a transmembrane carrier and a cryoprotectant encapsulated in the transmembrane carrier. The cryoprotectant is selected from a sugar cryoprotectant, a glycol cryoprotectant or an amine cryoprotectant. Therefore, the vitrification cryoprotectant of the present invention comprises a transmembrane carrier and a cryoprotectant encapsulated in the transmembrane carrier. It can not only avoid the formation of ice crystals in cells, but also greatly reduce the toxicity of cryoprotectants to cells, improve the survival rate of cells, and ensure the normal development of cells.

【技术实现步骤摘要】
一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及生殖冷冻领域，具体而言，涉及一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法。
技术介绍
生殖冷冻保存是指通过特殊的保护措施和降温程序，使生殖细胞和胚胎等在-196℃条件下停止代谢，而升温后又回复代谢能力的技术。随着体外受精-胚胎移植及其衍生技术的不断发展，涉及生殖细胞和胚胎的生殖冷冻保存技术已经成为人类辅助生殖领域或动物育种领域中必不可少的组成部分。目前，常规的生殖冷冻技术包括慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。其中，慢速冷冻法是大多数哺乳动物生殖冷冻保存的主要方法。该方法选择较低浓度的渗透性防冻剂，采用缓慢降温和快速解冻的方法来保存冷冻生殖。常规慢速冷冻法可以分为以下6个步骤：(1)室温下生殖细胞或胚胎置于低分子量渗透性防冻液中5～10min，使生殖细胞/胚胎和冷冻液间达到平和；(2)在-5～-7℃植冰；(3)以0.2～2℃/min的速度缓慢降温；(4)降温到-30～-70℃，投入液氮中保存；(5)以250℃/min的速度快速解冻(例如25℃水中)；(6)在培养或移植前，室温下除去防冻剂[1]。玻璃化冷冻是通过高浓度冷冻保护剂在冷冻过程中固化形成无结构的玻璃样物质从而减少细胞内外冰晶的形成以保护生殖的冷冻方法。所述无结构的玻璃样物质的质点不规则排列，能始终保持溶液的水分子和离子分布，使跨膜物质的浓度和渗透压差别不大，从而避免细胞内产生冰晶对细胞的机械性损伤，也消除细胞外冰晶形成引起的理化损伤[2]。与慢速低温冷冻法相比，玻璃化冷冻法无需降温仪精密控制降温速度，仅需1分钟即可完成，简化操作过程，大大缩短操作时间，同时玻璃化冷冻能大幅度提高生物样品的冷冻速率，使生物样品迅速穿过危险区温区，同时减少冰晶对细胞骨架、膜完整性等的损伤，对细胞的冷冻损伤更小。因此，玻璃化冷冻技术已经成为生殖冷冻技术新方向。而尽管玻璃化冷冻技术存在诸多优势，已经成为发展趋势之所在，但现有的玻璃化冷冻技术仍然存在一定的瓶颈，限制其推广和应用，具体而言，主要表现在：(1)玻璃化液需要加入高浓度的低温保护剂以避免冷冻过程中冰晶的形成。一般而言，渗透性低温保护剂浓度≥4M，非渗透性低温保护剂浓度≥0.5M。而高浓度的低温保护剂具有毒性，影响生殖细胞的质量以及胚胎的生长发育。例如，二甲基亚砜增加细胞外钙离子向细胞内流动，造成细胞的潜在损害，影响细胞的分化和DNA的甲基化。而乙二醇浓度过高，则会影响细胞线粒体的功能。就目前的玻璃化冷冻效果而言，胚胎的发育率、临床妊娠率和着床率难以达到令人满意的水平。(2)发生玻璃化转变的生殖细胞或胚胎一直保存在液氮中，当需要恢复其活性时，必须复温到环境温度，但在复温过程中，玻璃化细胞及其周边冷冻保护液溶液容易却极其容易再次形成冰晶，对细胞造成严重的损伤。为解决上述技术问题，现有技术尝试在生殖冷冻用玻璃化液中加入脯氨酸，以降低二甲基亚砜以及乙二醇等渗透型冷冻保护剂的使用，从而减少二甲基亚砜以及乙二醇等对细胞的毒害作用。但上述尝试不能完全避免二甲基亚砜以及乙二醇的使用。CN104839144A虽然在玻璃化冷冻液中加入脯氨酸，但其仍需要加入5～15v/v％的二甲基亚砜以及乙二醇，因此，仍然对细胞具有一定的毒害作用。其次，现有技术还尝试在冷冻用玻璃化液中加入纳米颗粒，依靠纳米颗粒的高导热性，在复温过程中避免细胞内外再次结晶。但现有的纳米颗粒，例如二氧化钛纳米颗粒等对细胞具有较强的毒性，影响细胞的存活率和发育率。因此，本领域亟待对现有的生殖冷冻用玻璃化液进行改进，以期极大地降低DMSO以及乙二醇的用量，甚至完全不使用DMSO和乙二醇，并减少纳米颗粒对细胞的毒性。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂，其中所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，该细胞内保护剂利用跨膜载体将糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻保护剂或胺类冷冻保护剂转运到细胞内，在避免细胞内形成冰晶同时，还能够极大地降低冷冻保护剂对细胞的毒性，提升细胞的存活率，保障细胞的正常发育；进一步的，本专利技术所述细胞类冷冻保护剂优选为葡萄糖、脯氨酸，在复温之后，葡萄糖可以直接被细胞消耗利用，而脯氨酸则可以通过被动扩散的方式从细胞内扩散到细胞外中；进一步地，本专利技术所述玻璃化冷冻试剂还包括细胞外玻璃化冷冻试剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂同样选自糖类、糖醇类或胺类冷冻保护剂，可减少冷冻保护剂对细胞的毒性；更进一步地，本专利技术所述细胞外玻璃化冷冻试剂中还包括表面包裹有由超低粘度海藻酸或其衍生物交联形成的凝胶层的石墨烯纳米颗粒，所述纳米颗粒包裹的凝胶层极薄，不但可以极大减少、甚至基本消除石墨烯纳米颗粒对细胞的毒性，同时还保有良好的导热性能，可以有效避免重结晶；更进一步地，本专利技术所述石墨烯纳米颗粒为磁性石墨烯纳米颗粒，可通过电磁感应加热辅助冻存细胞的复温，同时，所述磁性石墨烯纳米颗粒可以容易地与冻存细胞分离并回收。本专利技术的第二目的在于提供一种用于玻璃化冷冻的试剂盒，所述试剂盒包括前述玻璃化液和其他辅助试剂，便于储存、运输和使用。本专利技术的第三目的在于提供前述细胞内玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化液中的应用。本专利技术的第四目的在于提供前述细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化液中的应用。本专利技术的第五目的在于提供一种生殖冷冻保存方法，所述方法使用前述玻璃化液或试剂盒进行生殖冷冻保存，所述保存方法可减少低温保护剂对细胞的毒性以及避免复温过程出现重结晶。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂，所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂。本专利技术还涉及用于玻璃化冷冻的试剂盒，所述试剂盒包前述玻璃化冷冻试剂和其他辅助试剂。本专利技术还涉及前述细胞内玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化液中的应用。本专利技术还涉及述细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂中的应用。本专利技术还涉一种生殖冷冻保存方法，所述方法使用前述玻璃化冷冻试剂或者前述试剂盒进行生殖冷冻保存。具体实施方式本专利技术涉及用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂，所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所述细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂。在玻璃化冷冻过程中，现有的玻璃化液主要依靠渗透型冷冻保护剂，例如，二甲基亚砜、乙二醇或脯氨酸，渗入到细胞内部，提高细胞内渗透压，避免因降温而形成细胞内冰晶。但二甲基亚砜和乙二醇对细胞具有较大的毒性。而通过离子通道转运入细胞内的脯氨酸数量有限，为避免细胞内冰晶形成，添加有脯氨酸的玻璃化液仍然需要一定浓度的二甲基亚砜或者乙二醇，对细胞仍然存在伤害。为解决上述技术问题，本专利技术在前述生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂中包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所述细胞内玻璃化冷冻试剂采用跨膜载体将糖、糖醇或胺类冷冻保护剂包裹起来，通过所述跨膜载体的运输作用能够将大量的糖、糖醇或胺类冷冻保护剂运输到细胞内，从而在玻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂，其中：所述细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的浓度为0.5~2M，选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂；所述玻璃化冷冻试剂还包括细胞外玻璃化冷冻试剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂包括冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的浓度为2.5~3.5M，选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻保护剂、胺类冷冻保护剂或多聚物类冷冻保护剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂与所述细胞内玻璃化冷冻试剂单独包装；所述细胞外玻璃化冷冻试剂中还包括石墨烯纳米颗粒，其中所述石墨烯纳米颗粒的表面包被有经超低粘度海藻酸或其衍生物交联而形成的凝胶层，所述超低粘度海藻酸的cps为30~70，所述超低粘度海藻酸的衍生物为超低粘度海藻酸钠。

【技术特征摘要】
1.生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂，其中：所述细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的浓度为0.5~2M，选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂；所述玻璃化冷冻试剂还包括细胞外玻璃化冷冻试剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂包括冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的浓度为2.5~3.5M，选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻保护剂、胺类冷冻保护剂或多聚物类冷冻保护剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂与所述细胞内玻璃化冷冻试剂单独包装；所述细胞外玻璃化冷冻试剂中还包括石墨烯纳米颗粒，其中所述石墨烯纳米颗粒的表面包被有经超低粘度海藻酸或其衍生物交联而形成的凝胶层，所述超低粘度海藻酸的cps为30~70，所述超低粘度海藻酸的衍生物为超低粘度海藻酸钠。2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂中，所述冷冻保护剂的浓度为0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2.0M。3.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述冷冻保护剂的浓度为2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3.0M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M或3.5M。4.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中：所述糖类冷冻保护剂选自单糖、二糖或三糖，所述单糖、二糖或三糖选自葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖。5.根据权利要求4所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述糖类冷冻保护剂为葡萄糖。6.根据权利要求4所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述糖醇类冷冻保护剂选自甘露糖醇或山梨醇。7.根据权利要求4所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述胺类冷冻化保护剂选自脯氨酸、羟脯氨酸或甜菜碱。8.根据权利要求7所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述胺类冷冻化保护剂为脯氨酸。9.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的多聚物选自人血清蛋白、Ficoll、羟乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯二醇或聚乙烯吡咯烷酮。10.根据权利要求9所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述多聚物为人血清蛋白。11.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：严杰，乔杰，李蓉，刘平，郑晓英，黄锦，庄新杰，李军生，林胜利，袁一峰，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：北京,11