一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种软骨藻酸类毒素检测方法，尤其是涉及一种免疫亲和柱净化‑液相色谱‑串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，其利用高性能、强识别的DA毒素免疫亲和柱，并结合高灵敏性和精确性的液相色谱‑串联质谱检测不同海洋生物中DA毒素的分析测定，能有效解决前处理中样品净化不理想的问题，并减少样品基质干扰，缩短分析时间，提高方法回收率，填补免疫亲和技术在软骨藻酸类毒素检测领域的空白。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法
本专利技术涉及一种软骨藻酸类毒素检测方法，尤其是涉及一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法。
技术介绍
记忆缺失性贝毒(ASP)是有毒赤潮硅藻分泌产生的毒素，其主要活性成分软骨藻酸(domoicacid，DA)是一种神经性氨基酸类毒素。该毒素最早是在1987年加拿大爱德华王子岛东海岸因食用紫贻贝而造成的中毒死亡事件中被发现的。中毒者主要表现为腹痛、腹泻、呕吐，并伴有严重的头痛、记忆丧失、意识混乱、昏迷等症状。研究发现，DA主要由多列拟菱形藻产生。贝组织中软骨藻酸含量达到40mg/kg时可引起食用者中毒，150mg/kg时有致死危险，人类通过进食可耐受的最大限量为20mg/kg，加拿大首先制定了安全限量标准为20μg/g贝肉，欧洲、日本也相继将该种毒素列为贝类常规检测项目。中国对DA的研究还属于起步阶段，尚缺乏有效的检测手段和监控网络。虽然目前在我国检出DA的报道还很罕见，但在中国沿海已经检测到多种产毒的拟菱形藻藻株。考虑到该毒素毒性大、反应快、无解毒剂，开展海洋生物中DA毒素的检测研究对确保水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫亲和柱净化‑液相色谱‑串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min，7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中，得一次提取液；再往剩余残渣中加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，重复提取一次，得二次提取液；合并一次提取液和二次提取液后定容至20mL，得提取液；移取1mL提取液至另一50mL离心管中，加入5mL PBS缓冲液进行稀释，得待净化的样品液；(2)免疫亲和柱净化：取一DA单克隆抗体免疫...

【技术特征摘要】
1.一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min，7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中，得一次提取液；再往剩余残渣中加入8mL体积浓度为75％的甲醇水溶液，重复提取一次，得二次提取液；合并一次提取液和二次提取液后定容至20mL，得提取液；移取1mL提取液至另一50mL离心管中，加入5mLPBS缓冲液进行稀释，得待净化的样品液；(2)免疫亲和柱净化：取一DA单克隆抗体免疫亲和柱，待其恢复至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液；上样结束后，用6mL体积浓度为50％甲醇水溶液淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用3mL含有质量浓度2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用1mL初始流动相定容溶解，经0.22μm滤膜过滤后供液相色谱-质谱进行分析。2.根据权利要求1所述的一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PBS缓冲液通过以下方法制得：分别称取二水合磷酸二氢钠2.18g，十二水合磷酸氢二钠12.90g，氯化钠8.50g，用水溶解并定容至1000mL。3.根据权利要求1所述的一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定软骨藻酸类毒素的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述DA单克隆抗体免疫亲和柱通过以下方法制得：(a)合成免疫原在小烧瓶中依次加入10mg的牛血清白蛋白，2mL0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得免疫原DA-BSA；(b)合成检测原在小烧瓶中依次加入10mg的鸡卵清白蛋白，2mL0.05M、pH7.4的乙酸钠缓冲液，1mg的软骨藻酸，60μL质量浓度为37％的甲醛溶液，混匀，37℃搅拌48h，然后用0.1M、pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，得检测原DA-OVA；(c)单克隆抗体制备及纯化取5只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多点注射DA-BSA，20μg/只，免疫4周后开始加强免疫，每隔2周加强免疫1次；初次免疫时，用免疫原DA-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用免疫原DA-BSA与等体积弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量、免疫方式不变；第2次加强免疫10天后，取小鼠尾静脉血检测，包被检测原DA-OVA，用间接竞争ELISA法检测血清的效价，选择效价最高的BALB/c小鼠用于制备杂交瘤细胞，融合前3天小鼠腹腔...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈思，张小军，严忠雍，
申请(专利权)人：浙江省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33