用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法技术

本发明专利技术涉及线粒体DNA分子检测领域，特别涉及用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法。用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内。本发明专利技术巧妙地将长程PCR的两条引物均设计在人类线粒体DNA的重链复制原点邻近区域，避免了因为引物落入删除区域而导致漏检的问题；本发明专利技术的扩增区域长达16397bp，几乎扩增整个环形线粒体DNA，可覆盖环形线粒体DNA上几乎所有可能的删除类型，形成了一种检测范围广、灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法
本专利技术涉及线粒体DNA分子检测领域，具体而言，涉及用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法。
技术介绍
线粒体是细胞内一种提供能量的细胞器，在人体除了成熟的红细胞以外，其他所有的细胞都含有数量不等的线粒体。线粒体是双膜结构，有独立的可以半自主复制的遗传物质即线粒体DNA。在线粒体内可完成多种生物化学反应，主要是氧化磷酸化过程。氧化磷酸化是将丙酮酸和脂肪酸等底物氧化成水和二氧化碳的过程，在此过程中产生的三磷酸腺苷(ATP)为细胞活动提供能量。线粒体功能受损，可导致氧化磷酸化过程中ATP产生缺陷，从而引起细胞代谢紊乱并出现一系列的临床症状。骨骼肌和神经系统中由于存在大量线粒体，耐缺氧能力较差，因此对ATP供应不足最敏感，成为发病率最高的器官。临床上表现为LHON综合征(Leber遗传性视神经病)；MERRF综合征(肌阵挛性癫痫发作、小脑共济失调、乳酸血症和碎红肌纤维)；MELAS综合症(线粒体肌病、脑病、乳酸中毒、卒中样发作)；Leigh病(亚急性坏死性脑脊髓病)；KSS综合征(视网膜色素变性、心脏传导阻滞和眼外肌麻痹)；Pearson综合征(骨髓-胰腺综合征)；CPEO综合症(慢性进展性眼外肌麻痹)；Alpers病(家族性原发性进行性灰质萎缩症)；MNGIE综合征(线粒体周围神经病并胃肠型脑病)；NARP综合征(视网膜色素变性共济失调性周围神经病)；Menke病(卷毛型灰质营养不良)；wolfram综合征(视神经萎缩、耳聋、糖尿病)；线粒体心肌病等。另外，线粒体功能受损还与其他一些疾病如帕金森病、肿瘤、冠心病等相关。虽然人类线粒体自身基因组只编码13种蛋白质，约相当于线粒体生命活动总蛋白质的1％不到，但目前已知的线粒体疾病绝大多数来源于线粒体基因编码蛋白质的缺失或缺陷。线粒体DNA(线粒体DNA)是独立于细胞核染色体外的又一基因组，虽然它仅由16569个碱基组成，但其表达对于维持细胞的生理功能至关重要。与核DNA相比，线粒体DNA更易于发生突变。核DNA具有完善的突变纠正机制，但线粒体只有有限的DNA修复机制(如线粒体DNA聚合酶无校对功能,不能像核基因那样去除变异的碱基)；机体95％以上的氧自由基来自于线粒体，线粒体呼吸链产生的氧自由基积累会导致线粒体DNA的损伤和突变；线粒体DNA缺乏组蛋白保护；线粒体DNA没有内含子，突变易损害重要的功能区。这些因素使得线粒体DNA的突变率非常高，从而导致线粒体病。至今已发现几百种线粒体DNA异常，这些发现很大程度上丰富了我们对线粒体病的认识。线粒体基因的检测在线粒体病的确诊过程中具有举足轻重的意义。线粒体DNA的异质性(heteroplasmy)是影响线粒体DNA检测准确性的一个重要因素。与核基因组不同，线粒体DNA以多拷贝形式存在于线粒体中，而同一个细胞又拥有数百至上千个线粒体。线粒体DNA的突变可发生在大量不同的线粒体DNA分子上，突变的线粒体DNA(突变型)可以和正常的线粒体DNA(野生型)共存，突变体含量可在0％～100％之间，突变型与野生型的比率是线粒体疾病发病机制中的重要决定因素。受精卵经过卵裂和胚胎发育，最终仅有几个拷贝的线粒体DNA分子进入新生儿的组织细胞中。体细胞每经历一次有丝分裂，线粒体DNA又会随着线粒体一起被随机分配到子代细胞中。因此，同一母系家族成员间、同一患者各个组织间的突变型与野生型的比例常常会大不相同。这导致目前发现的很多线粒体病先证者都是散发的，先证者中检测到的突变很少能在其母亲体内检测到。患者各个组织中突变载荷(突变型线粒体DNA占总的线粒体DNA的比例)的差别，也对检测样本来源提出了要求，一般推荐使用不分裂组织来源的细胞，如肌肉、脑组织等。而血液样本检测效果较差，容易造成假阴性，但是肌肉样本或脑组织样本取样困难，不易获得受检者的配合。线粒体DNA的缺陷，主要包括点突变、大片段删除、线粒体DNA总量减少等三种类型。其中线粒体DNA的点突变及小的插入缺失(indels)，以及线粒体相关核基因的点突变及indels，现在都可以使用成熟的二代测序技术(nextgenerationsequencing；NGS)进行检测，二代测序技术还可以根据突变位点的reads数和该位点的总reads数，计算出突变位点的突变载荷。相对而言，线粒体DNA的大片段删除及线粒体DNA的数量减少一直缺乏快速、准确且灵敏的检测方法。目前常用的检测技术有4种，阐述如下：1、southern-blot杂交技术。southern-blot杂交技术的原理是使用限制性内切酶将环形的线粒体DNA酶切成线性，线性线粒体DNA经凝胶电泳后，正常大小的野生型线粒体DNA(16569bp)与发生删除的突变型线粒体DNA会相互分离开来，然后使用线粒体DNA的D-Loop区或整个线粒体DNA作为标记探针，对分离的线性线粒体DNA进行杂交显色，从而判断是否存在异常大小的线性线粒体DNA条带。southern-blot杂交技术优势是几乎不会出现假阳性，但是技术流程长、操作费时费力，从实际应用看，难以对待检样本随到随检，需要积累一定数量样本成批检测以降低成本，最关键的是检测灵敏度低，鉴于这些缺点，目前已不推荐使用southern-blot杂交技术检测线粒体DNA的大片段删除。2、Gap-PCR技术。环形线粒体DNA发生大片段删除后，当一对引物正好位于线粒体DNA断裂位点两侧的适当位置时，野生型线粒体DNA模板扩增出的DNA片段大小，会与删除型线粒体DNA模板扩增出的DNA片段大小不一致(删除型线粒体DNA模板扩增出的DNA片段较小)，对较小片段进行一代测序，可以准确分析出线粒体DNA的断裂位点。Gap-PCR技术操作简单快速，可以准确显示出线粒体DNA断裂位点。但是，由于每个受检者线粒体DNA断裂位点未知，需要同时设计多对引物进行Gap-PCR，直到有一对引物正好位于断裂位点两侧的适当位置，才能达到检测目的，也就是说检测过程其实就是一个断裂位点的摸索查找过程，这造成了实验和分析的麻烦，每个受检者的线粒体DNA断裂位点不同，从而使得方法的通用性难以满足要求，且耗时费力。3、MLPA技术。MLPA技术自2011年起开始应用于线粒体DNA的删除及重复检测，是一种新型的半定量线粒体DNA删除重复检测技术，由荷兰MRC公司开发应用。该技术设计了位于线粒体DNA不同部位的37对探针，与野生型线粒体DNA模板杂交后，探针对中的两条探针首尾相邻，在连接酶的作用下，可以连接成一条完整的DNA单链模板。37对探针连接后，使用通用引物进行PCR扩增，每个探针对连接产物扩增产生的PCR片段大小各不相同(每对探针中的两条探针5’端或3’端带有通用引物序列。使用填充序列使得PCR产物大小不一，产物大小为预先设定)，然后使用毛细管电泳进行片段筛选区分各个大小不同的PCR产物，根据PCR产物的长度(bp数)，判断探针对在线粒体DNA上的位置，根据PCR产物的丰度(峰高)，判断线粒体DNA上该探针对所处位置是否发生删除或重复，如果探针对所处的线粒体DNA部位发生删除，PCR产物丰度降低，如果探针对所处的线粒体DNA部位发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内；进一步地，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内；进一步地，所述引物对的核酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、用于大片段扩增的DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水中的任一种或几种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于大片段扩增的DNA聚合酶为PrimeSTARGXL聚合酶或PrimeSTARMaxDNA聚合酶。5.人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法，其特征在于，待检测线粒体基因组作为模板，以权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到的产物进行电泳检测，判断所述待检测线粒体基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红星，崔英祥，魏琳力，
申请(专利权)人：北京纳诺基生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11