一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法，首先向肝素钠样品中加入裂解液，待充分裂解后进行离心，取上清液转入DNA吸附柱中，然后加入漂洗液进行漂洗，最后加入Buffer E或者灭菌水进行洗脱，洗脱液即为基因组DNA溶液。本发明专利技术方法步骤简单，影响因素少，重复性和重现性高，并且简单快速，2h内即可获得超纯的基因组DNA片段，极大的消除了肝素对PCR实验的抑制，解决了现有技术中需要采用肝素酶来清除肝素带来的成本高、处理时间长的问题，本发明专利技术方法提取的基因组DNA可直接用于PCR等其它分子生物学下游实验，提取过程中无任何有毒的试剂，环保安全，还可配合自动化核酸提取仪，高通量提取DNA。

【技术实现步骤摘要】
一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法
本专利技术涉及一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法，属于生物

技术介绍
肝素(Heparin)是一种由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸以及他们的硫酸化衍生物组成的酸性粘多糖，具有强酸性，并高度带负电荷，因其首先从肝脏发现而得名肝素。肝素天然存在于哺乳动物的肥大细胞和中性粒细胞中，也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。肝素于1935年正式应用于临床治疗，传统应用价值为抗凝血和抗血栓，至今已有70余年历史。目前，它仍是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由粗品肝素作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用途，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。而且，肝素是世界上迄今为止已知的分子结构最复杂的化合物，短期内无法人工化学合成，到目前为止，仍然没有完全代替的药品。在过去几十年，欧美国家所使用的肝素原料主要从牛肺、牛肠或猪小肠黏膜中提取。然而由于“疯牛病”的传播以及其巨大影响，美国和西方欧洲国家加强了对动物来源的药品，食品和饲料等的质量控制，防止动物饲料和人类食品、药品被疯牛病病毒或其他病毒污染。2012年2月，美国FDA公布了《肝素钠粗品质量监控的工业指南，HeparinforDrugandMedicalDeviceUse:MonitoringCrudeHeparinforQuality》，要求肝素药品生产企业更严格地控制肝素原料可能含有的多硫酸软骨素(OSCS)或反刍动物污染的非猪源性原材料，还要求生产企业审核肝素粗品和原料药供应商的生产过程，以确保符合cGMP规定。因此，粗品肝素中反刍动物基因的含量是出口肝素检测的重要指标之一。目前，反刍动物基因含量的检测主要为实时定量PCR方法，又称实时荧光PCR，是在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离，该方法融合了PCR的灵敏性，DNA杂交的特异性和光谱技术的定量准确性，具有封闭反应污染少，灵敏度高特异性强，定量准确范围宽，自动化效率高，操作安全迅速等优点。但由于肝素对PCR反应具有较强的抑制作用(肝素本身是PCR的强烈抑制剂，50μlPCR反应体系中，低于0.002U的肝素就可以强烈抑制PCR的进行)，若要使得这一便捷的测定方法得到广泛推广使用，需要在从肝素制品中提取残留的基因组DNA时有效清除肝素的残留对PCR的影响。现有的清除肝素的主要方法一般是使用肝素酶消化处理样本，但该过程处理时间较长，一般为18小时左右，且肝素酶价格昂贵，再者，肝素酶的稳定性较差，肝素酶I以液体形式存放在4℃环境下，在很短的时间内活性即降低为原来的50％，而经过一次冻融、一次冻干其活性只能保持为原来的45％和25％，这样对实验操作提出了非常苛刻的要求，稍有不当就会导致检测结果不准，甚至检测失败。基于这些原因，在一定程度上限制了PCR测定法的使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术的不足，提供一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法，可以快速简单地从肝素钠样品中提取残存的基因组DNA，提取的DNA纯度高，极大地消除了肝素对PCR的抑制，所得产物可方便的用于后续PCR检测。技术方案一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：(1)往10ml无菌水中加入300mg待检测的肝素钠样品，溶解完全后得到肝素钠溶液；(2)取100μl肝素钠溶液于离心管中，加入500μl的BufferL，混匀后加入60μlBufferS，继续混合均匀，然后将离心管置于60℃水浴中保持15min，后冷却至室温；(3)12000rpm离心10min后，将得到的上清液转移至套有收集管的硅胶膜DNA吸附柱中，静置后，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(4)往步骤(3)的硅胶膜DNA吸附柱中加入600μlBufferW1，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(5)往步骤(4)的硅胶膜DNA吸附柱中加入600μlBufferW2，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(6)取出硅胶膜DNA吸附柱，将其装入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱的膜中央加入100μlBufferE或者灭菌水，室温放置后，10000rpm离心3min，离心管中收集得到的洗脱液，即为基因组DNA溶液。可用于下游的Real-timePCR检测；长期存放，保存于-20℃，以防DNA降解。进一步，步骤(2)中，所述BufferL的组成为：10mMTris-Cl,1mMEDTA，4MLiCl。进一步，步骤(2)中，所述BufferS为3MNaAc,pH为5.3。进一步，步骤(2)中，60℃水浴过程中，每隔5min振荡一次，有助于样品充分溶解。进一步，步骤(4)中，所述BufferW1的组成为10mMTris-Ac,4MLiCl,2mMEDTA,30μg/mlBSA,3MNaAc,pH5.3。进一步，步骤(4)的操作结束以后，再重复一次。进一步，步骤(5)中，所述BufferW2的组成为200mMNaCl，10mMEDTA，50mMTris-Cl，pH7.5。进一步，步骤(5)的操作结束以后，再重复一次，其中，离心时间为3min，便于除去残留的溶液。进一步，步骤(6)中，BufferE的组成为：10mMTris-Cl,1mMEDTA,pH7.5。进一步，步骤(6)中，BufferE或者灭菌水的温度为55℃，可以增加DNA回收率。进一步，步骤(6)中，室温静置的时间为10min以上，可以增加DNA回收率。本专利技术的有益效果：本专利技术利用高特异性硅胶膜DNA吸附柱，配合专项开发的缓冲液系统，使DNA与肝素等杂质有效的分离，获得高纯度的基因组DNA片段，本专利技术方法的操作步骤简单，只需实验室常规仪器，影响因素少，实验重复性和重现性高，并且简单快速，2h内即可获得超纯的基因组DNA片段，提取的DNA纯度高，可直接用于PCR等其它分子生物学下游实验，提取过程中无任何有毒的试剂，环保安全，还可配合自动化核酸提取仪，高通量提取DNA。附图说明图1为实施例1提取的基因组DNA的凝胶电泳图；图2为实施例1提取的基因组DNA的猪引物的实时定量PCR溶解曲线；图3为实施例1提取的基因组DNA的猪引物的实时定量PCR扩增曲线；图4为实施例1提取的基因组DNA的猪引物的实时定量PCR标准曲线；图5为实施例1提取的基因组DNA的牛引物的实时定量PCR溶解曲线；图6为实施例1提取的基因组DNA的牛引物的实时定量PCR扩增曲线；图7为实施例1提取的基因组DNA的牛引物的实时定量PCR标准曲线；图8为实施例1提取的基因组DNA的羊引物的实时定量PCR溶解曲线；图9为实施例1提取的基因组DNA的羊引物的实时定量PCR扩增曲线；图10为实施例1提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)往10ml无菌水中加入300mg待检测的肝素钠样品，溶解完全后得到肝素钠溶液；(2)取100μl肝素钠溶液于离心管中，加入500μl的Buffer L，混匀后加入60μl Buffer S，继续混合均匀，然后将离心管置于60℃水浴中保持15min，后冷却至室温；(3)12000rpm离心10min后，将得到的上清液转移至套有收集管的DNA吸附柱中，静置后，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(4)往步骤(3)的DNA吸附柱中加入600μl Buffer W1，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(5)往步骤(4)的DNA吸附柱中加入600μl Buffer W2，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(6)取出DNA吸附柱，将其装入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱的膜中央加入100μl Buffer E或者灭菌水，室温放置后，10000rpm离心3min，离心管中收集得到的洗脱液，即为基因组DNA溶液。

【技术特征摘要】
1.一种从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)往10ml无菌水中加入300mg待检测的肝素钠样品，溶解完全后得到肝素钠溶液；(2)取100μl肝素钠溶液于离心管中，加入500μl的BufferL，混匀后加入60μlBufferS，继续混合均匀，然后将离心管置于60℃水浴中保持15min，后冷却至室温；(3)12000rpm离心10min后，将得到的上清液转移至套有收集管的DNA吸附柱中，静置后，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(4)往步骤(3)的DNA吸附柱中加入600μlBufferW1，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(5)往步骤(4)的DNA吸附柱中加入600μlBufferW2，10000rpm离心1min，弃去离心分离的废液；(6)取出DNA吸附柱，将其装入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附柱的膜中央加入100μlBufferE或者灭菌水，室温放置后，10000rpm离心3min，离心管中收集得到的洗脱液，即为基因组DNA溶液。2.如权利要求1所述从肝素钠样品中提取基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述BufferL的组成为：10mMTris-Cl,1mMEDTA，4MLiCl；所述BufferS为3MNaAc,pH为5.3。3.如权利要求1所述从...

【专利技术属性】
技术研发人员：严林俊，陆毅祥，
申请(专利权)人：南通科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32