一种益生菌胞外多糖的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种益生菌胞外多糖的提取方法。采用的技术方案是：将益生菌发酵液离心除去沉淀菌体，加入80‑100目聚酰胺振荡2‑10h，抽滤回收聚酰胺，取滤液减压浓缩至原体积的20‑80％，调pH值至5‑9，加1‑5倍体积95％乙醇，4℃静置2‑16h，离心倾去上清液，沉淀用适量蒸馏水溶解，透析后冷冻干燥保存。本发明专利技术明确了从益生菌发酵液中提取胞外多糖的过程中除蛋白的方法和醇沉的工艺，采用本发明专利技术的方法可以有效提高益生菌胞外多糖的得率，获得有一定抗氧化活性的胞外多糖。

Extraction of extracellular polysaccharides from probiotics

The invention discloses a method for extracting probiotic extracellular polysaccharides. The technical scheme adopted is: centrifuge the fermentation broth of probiotics to remove sediment bacteria, add 80 100 mesh polyamide to shake for 2 10 h, filter and recover polyamide, concentrate the filtrate to 20 80% of its original volume by decompression, adjust the pH value to 5 9, add 1 5 times volume of 95% ethanol, leave it at 4 16 h, centrifuge and dump the supernatant, precipitate with proper amount of distilled water, and freeze-dry after dialysis. The method for extracting extracellular polysaccharides from probiotic fermentation broth and the process for alcohol precipitation are described. The method can effectively improve the yield of extracellular polysaccharides from probiotic fermentation broth and obtain extracellular polysaccharides with certain antioxidant activity.

【技术实现步骤摘要】
一种益生菌胞外多糖的提取方法
本专利技术涉及一种益生菌胞外多糖的提取方法，属于微生物学领域。
技术介绍
益生菌胞外多糖是指一些益生菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的次级代谢产物，根据其与细胞壁结合的能力强弱可分为两种，一种失去与细胞结合的能力而渗入培养基形成粘液，称粘液多糖；另一种粘附于细胞壁形成荚膜，称荚膜多糖。在自然环境中，胞外多糖通常起着保护微生物的作用，它可以避免细胞干燥脱水，遭噬菌体浸染、受抗生素或者有毒物质损害、原生动物伤害，还可以稳定渗透压、支持细胞结构、参与细胞信息传递和细胞构成等。益生菌胞外多糖作为一种安全的天然产物，因其独特的理化特性，越来越多地被应用于食品工业中。它能改善乳制品和豆乳制品的流变性、乳化性、黏着性以及质构特性，使其变得更加细腻均匀、平滑稠密，还能提高焙烤类食品保水性，改善面包体积和柔软度。近年来，随着研究的深入，益生菌胞外多糖的抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等生理功能也逐渐引起人们的关注。目前，胞外多糖提取过程中除蛋白的方法多采用三氯乙酸法，该法反应剧烈，极易破坏多糖的结构，且三氯乙酸本身具有毒性，此法得到的多糖不利于功能性研究与应用。由于益生菌菌株本身特性不同，现有生产方法中，其胞外多糖产量从几十到几百毫克每升不等，得率较低，制约其大规模生产，因此如何提高产量与提取量是目前急需解决的问题。当前我们对优化培养基成分与发酵条件提高胞外多糖产量的研究较多，而对优化从发酵液中提取胞外多糖的研究甚少。
技术实现思路
针对益生菌胞外多糖提取量的问题，本专利技术的目的是提供一种能提高益生菌胞外多糖提取量的制备方法。本专利技术采用的技术方案是：一种益生菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：1)除菌体：将益生菌发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min，除去沉淀菌体，保留上清液；2)除蛋白：向步骤1)中所得的上清液中加入聚酰胺，室温下置于摇床振荡2-10h，使蛋白质吸附于聚酰胺，然后抽滤去除聚酰胺；3)浓缩：将步骤2)所得滤液浓缩至原体积的20-80％，得浓缩液；4)醇沉：调节浓缩液的pH，加入95％乙醇，4℃静置，离心，倾去上清液，沉淀用适量蒸馏水溶解后，置透析袋中透析24h，冻干保存。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤2)中，按固液比，聚酰胺：上清液＝40-200g：1L。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤2)中，按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1L。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤2)中，所述的聚酰胺粒径为80-100目。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤3)中，将步骤2)所得滤液浓缩至原体积的20％。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的95％乙醇的加入量是浓缩液的1-5倍。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的95％乙醇的加入量是浓缩液的4倍。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的静置的时间为2-16h。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，步骤4)中，所述的pH调节至5-9。上述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，所述的益生菌为鼠李糖乳杆菌。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术通过优化除蛋白和醇沉工艺，得出益生菌胞外多糖提取率较高且经济适用的除蛋白和醇沉条件。2.通过本专利技术的方法制备的益生菌胞外多糖具有抗氧化作用。3.本专利技术采用聚酰胺，通过吸附作用除去发酵液中的蛋白质及其它杂质，反应条件温和、无毒害，且聚酰胺能够回收利用，具有节能环保的特点。附图说明图1为本专利技术得到的鼠李糖乳杆菌胞外多糖，呈淡黄色粉末。图2为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对DPPH自由基的清除作用。图3为鼠李糖乳杆菌胞外多糖对OH自由基的清除作用。具体实施方式实施例1鼠李糖乳杆菌发酵液除蛋白条件的确定方法：1)活化：将鼠李糖乳杆菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlMRS培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得鼠李糖乳杆菌发酵种子液。2)发酵：将鼠李糖乳杆菌发酵种子液以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为6.5，于37℃下，转速为100r/min，培养24h，得发酵液。MRS液体培养基的组成为：低聚半乳糖1％，大豆蛋白胨2％，磷酸盐0.2％，酵母粉0.5％，柠檬酸氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，其余为蒸馏水。3)除菌体：将步骤2)中所得的发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min去除沉淀菌体，保留上清液。4)除蛋白：在步骤3)中所得的上清液中加入(80-100)目的聚酰胺，室温下摇床振摇，抽滤除去吸附蛋白质的聚酰胺。5)蛋白质清除率测定：用考马斯亮蓝法测定发酵液中剩余蛋白质的浓度，计算蛋白质的清除率。(一)不同除蛋白时间的影响方法同上。按固液比，聚酰胺：上清液＝80g：1L，向上清液中加入聚酰胺，振摇时间如表1。结果如表1：表1由表1可见，蛋白质清除率随振摇时间的延长而提高，振摇4h以上时，蛋白质清除率变化不明显，综合考虑除蛋白效果与时间成本，选择4h为最优除蛋白时间，蛋白质清除率可达56.8％。(二)不同聚酰胺添加量的影响方法同上。在除菌体后的上清液中加入聚酰胺，添加量如表2，振摇6h。结果如表2：表2由表2可见，蛋白质清除率随聚酰胺添加量的升高而提高，聚酰胺添加量大于120g/L时清除率变化不明显，综合考虑除蛋白效果与成本，选择120g/L为聚酰胺最优添加量，蛋白质清除率可达59.9％。由实施例1得出，鼠李糖乳杆菌胞外多糖的最佳除蛋白条件为：按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1L的比例加入聚酰胺，摇床振摇4h。实施例2鼠李糖乳杆菌发酵液浓缩条件的确定方法：1)活化：将鼠李糖乳杆菌从平板上活化，挑取单菌落至10mlMRS培养液，37℃，180rpm摇床培养12h，得鼠李糖乳杆菌发酵种子液。2)发酵：将鼠李糖乳杆菌发酵种子液以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，调节初始pH值为6.5，于37℃下，转速为100r/min，培养24h，得发酵液。MRS液体培养基的组成为：低聚半乳糖1％，大豆蛋白胨2％，磷酸盐0.2％，酵母粉0.5％，柠檬酸氢二胺0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，其余为蒸馏水。3)除菌体：将步骤2)中所得的发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min去除沉淀菌体，得上清液。4)除蛋白：按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1L，向上清液中加入(80-100)目的聚酰胺，室温下摇床振摇4h，抽滤除去吸附蛋白质的聚酰胺。5)浓缩：将步骤4)所得产物进行浓缩，得浓缩液。6)醇沉：向浓缩液中加入浓缩液三倍体积的95％乙醇，于4℃冷藏12h。于4℃条件下10000r/min离心10min，除去上清液，沉淀以定量蒸馏水溶解，即得胞外多糖溶液。冻干后称重，并计算胞外多糖得率。(一)浓缩体积分数的影响方法同上。发酵液经离心除菌体、除蛋白后，如表3进行浓缩。结果如表3：表3由表3可见，多糖得率随浓缩后体积的减小而增大。但当浓缩倍数过高时会导致醇沉得到的多糖颜色较深，且耗能较大。综合考虑得率与经济因素，选择浓缩至原体积的20％作为最优条件，多糖得率可达11.804g/L。实施例3鼠李糖乳杆菌胞外多糖醇沉条件的确定方法：1)活化：将鼠李糖乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种益生菌胞外多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1)除菌体：将益生菌发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min，除去沉淀菌体，保留上清液；2)除蛋白：向步骤1)中所得的上清液中加入聚酰胺，室温下置于摇床振荡2‑10h，使蛋白质吸附于聚酰胺，然后抽滤去除聚酰胺；3)浓缩：将步骤2)所得滤液浓缩至原体积的20‑80％，得浓缩液；4)醇沉：调节浓缩液的pH，加入95％乙醇，4℃静置，离心，倾去上清液，沉淀用适量蒸馏水溶解后，置透析袋中透析24h，冻干保存。

【技术特征摘要】
1.一种益生菌胞外多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1)除菌体：将益生菌发酵液在4℃条件下，10000r/min离心10min，除去沉淀菌体，保留上清液；2)除蛋白：向步骤1)中所得的上清液中加入聚酰胺，室温下置于摇床振荡2-10h，使蛋白质吸附于聚酰胺，然后抽滤去除聚酰胺；3)浓缩：将步骤2)所得滤液浓缩至原体积的20-80％，得浓缩液；4)醇沉：调节浓缩液的pH，加入95％乙醇，4℃静置，离心，倾去上清液，沉淀用适量蒸馏水溶解后，置透析袋中透析24h，冻干保存。2.根据权利要求1所述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)中，按固液比，聚酰胺：上清液＝40-200g：1L。3.根据权利要求2所述的一种益生菌胞外多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)中，按固液比，聚酰胺：上清液＝120g：1L。4.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡风庆，万姝含，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21