一种药物筛选方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供了一种药物筛选方法、试剂盒及其应用。所述的药物筛选方法直接从肿瘤发生的具体分子机制角度出发，以蛋白质‑蛋白质相互作用为靶点，通过直接利用标签肽段的抗体进行包埋反应，确保相互作用蛋白质活性位点的保持并高效率的进行靶向药物筛选，使其能够对蛋白质‑蛋白质相互作用进行检测，成功以此作为药物筛选的基础进行蛋白质相互作用靶向药物的筛选。本发明专利技术的筛选方法操作简单、成本低廉、效率高、实验材料容易获取；筛选手段目标明确，耗时短、易操作，并能直观、清楚地了解药物作用的具体分子机制，并且具有良好的通用性。同时，本发明专利技术还提供了基于所述的药物筛选方法构建的试剂盒，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种药物筛选方法、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物医药
，特别涉及一种药物筛选方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
目前基于肿瘤细胞功能进行筛选的药物开发方式虽然应用较为广泛，但不能清楚的解释抑制肿瘤恶化的具体分子机制，因此该筛选方式获得的药物存在较大的产生临床副作用的可能性，临床使用时也需要较多精力就可能出现的副作用制定应对策略，造成药物的临床推广使用困难，因此该传统筛选方式具有较大的实用缺点。此外，以单个基因或单个蛋白质为靶标进行靶向抗肿瘤药物筛选的方式具有普遍的应用实践，现有的大部分抗肿瘤药物如吉非替尼、拉帕替尼等均是基于该方式开发出的。然而大部分靶向单个基因或单个蛋白的抗癌药物在临床使用2～3个月后会出现患者临床耐药现象。研究发现，该耐药现象的出现主要是因为在药物作用的压力下，靶标基因或者蛋白会出现耐药突变，这些突变会导致该抗癌药物的药效降低或者消失，癌症患者因此不能继续依靠原来的靶向药物进行肿瘤治疗，造成治疗费用的浪费并延误宝贵的治疗时间。免疫酶联吸附试验(ELISA)是根据抗原-抗体结合的原理进行蛋白质定量的技术手段，目前在研究领域多用于分泌蛋白的检测，临床病理检测也常用该技术手段进行一些病理指标的判断。但传统的基于抗原-抗体结合的ELISA手段应用领域比较简单，并不能大规模的直接用于蛋白质-蛋白质相互作用的检测。现有的基于ELISA进行的药物筛选技术均将目标蛋白质直接包埋于ELISA酶标板上，这会造成因蛋白质活性位点埋进酶标板基质而无法使蛋白质相互作用的继续进行，因此得到假阴性的结果会大大增加。也有部分ELISA筛选药物技术通过将目标蛋白质固定在ELISA酶标板上，之后将活细胞放置在板上进行细胞膜蛋白质相互作用抑制剂的筛选，该筛选方式局限性较大，首先只能进行细胞膜蛋白相互作用的筛选，应用范围较窄；其次活细胞体外培养容易造成微生物污染，影响蛋白质相互作用的进行，继而影响筛选效果。老药新用是在已经获得批准在临床使用的药物中寻找药物新的功能，以寻求其对其他病症例如癌症等的治疗。因其具有已知的副作用及相应应对方法，因此是进行抗肿瘤等药物筛选和发现的重要途径之一。高效大规模地在大量已知的药物中筛选出能够抑制肿瘤发生发展的药物是进行新的抗肿瘤药物发现的重要前提。传统的药物筛选方式效率低、耗时长、药物作用机制不明确，从而导致新药开发的进程变得缓慢。因此，研究新的药物筛选系统对于抗癌药物(尤其是老药新用)的开发具有紧迫性和巨大的市场应用价值。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种药物筛选方法，所述的方法(superELISA)直接从肿瘤发生的具体分子机制角度出发，以蛋白质-蛋白质相互作用为靶点，创新地结合双夹心ELISA技术进行构建。本专利技术基于抗原-抗体结合的传统ELISA的原理基础上结合蛋白质纯化技术进行改良，通过制备带有肽段标签的蛋白质并进行纯化，直接利用标签肽段的抗体进行包埋反应，确保相互作用蛋白质活性位点的保持并高效率的进行靶向药物筛选，使其能够对蛋白质-蛋白质相互作用进行检测，成功以此作为药物筛选的基础进行蛋白质相互作用靶向药物的筛选；巧妙解决了直接将纯化后的蛋白质包埋于ELISA酶标板上不能确保相互作用位点能够暴露出来，有可能会埋进酶标板基质中，导致无法检测到相互作用现象的存在，出现阴性结果的技术难题。本专利技术的另一目的在于提供一种用于药物筛选的试剂盒。本专利技术的又一目的在于提供所述的药物筛选方法或试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种药物筛选方法，基于在病理机制中相互作用的第一蛋白质和第二蛋白质进行构建，包括如下步骤：(1)通过本领域常规方式获得保持活性的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白与第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白，所述的第一蛋白标签与第二蛋白标签不相同；(2)以ELISA常规包被方法对第一标签抗体进行包被后，洗板，然后进行封闭处理；(3)加入第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白进行孵育，洗板；(4)加入与第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白以及待筛选药物进行孵育，洗板；(5)加入与所述的第一标签抗体的来源属性不同第二标签抗体进行孵育，洗板；(6)加入能够结合第二标签抗体的酶标二抗进行孵育；(7)加入显色液，充分显色后立即加入终止液终止显色；若等待过久会造成过度显色，掩盖实验组和对照组的真实差异；(8)待显色稳定后进行双波长测定，按照OD450-OD630计算每个孔的吸光度值，分析待筛选药物对第一蛋白质和第二蛋白质相互作用的影响程度。步骤(1)所述的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白、第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白的纯度优选为95％以上。纯化后的蛋白质需在-80℃保存，不可反复冻融，不可长时间保存，会影响蛋白质活性。优选的，当所述的第一蛋白质为CDK1时，所述的第二蛋白质为KCTD12，可筛选得到通过破坏CDK1-KCTD12两个蛋白质的相互作用而抗肿瘤的药物；当所述的第一蛋白质为c-Raf1，所述的第二蛋白质为PHB1，可筛选得到通过破坏c-Raf1-PHB1两个蛋白质的相互作用而抗肿瘤的药物。所述的肿瘤可为结肠癌。步骤(1)中所述的第一蛋白标签和第二蛋白标签优选为his标签，gst标签或HA标签中的至少两种。所述的第一标签抗体和第二标签抗体的来源属性不同，是由于本专利技术的药物筛选方法是根据对第二标签抗体的含量水平检测(通过酶标二抗检测)实现的，如果两者的来源属性相同，则无法特异性检测第二标签抗体的含量，即第一标签抗体的存在会影响对第二标签蛋白抗体含量的检测。例如，当其中一种标签抗体为鼠源时，另一种标签抗体为兔源；所述的来源可以是鼠源、兔源、羊源、人源中的至少两种。步骤(2)中所述的第一标签抗体的浓度优选为1ng/μL。所述的第一标签抗体可用普通ELISA包被液进行稀释。所述的洗板优选用磷酸盐缓冲液进行清洗，洗板的次数优选为4～5次，每次洗板的时间优选为5分钟。步骤(2)所述的封闭处理的具体操作为：每孔加入300μL用PBS配制的5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)，37℃封闭2小时。步骤(3)中所述的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白的初始浓度优选为1～4mg/mL；步骤(3)中所述的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白在每孔中的终浓度优选为5～20μg/mL。步骤(4)中所述的第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白的初始浓度优选为1～4mg/mL；步骤(4)中所述的第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白在每孔中的终浓度优选为5～20μg/mL。步骤(3)中所述的孵育优选为室温慢摇5小时进行孵育；所述的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白可先用PBS溶液进行稀释。步骤(4)中所述的孵育优选为37℃静置孵育3～4小时；所述的第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白可先用PBS溶液进行稀释。步骤(4)中所述的待筛选药物包括一种活性成分或由至少两种活性成分组成的药物组合物；所述的药物优选为治疗癌症的药物。步骤(5)中所述的第二标签抗体的浓度优选为0.5μg/mL；所述的孵育优选为室温孵育2小时或者4℃孵育过夜；稀释所述的第二标签抗体的溶剂优选为5％(w/v)BSA溶液。步骤(6)中所述的酶标二抗优选为辣根过氧化酶标记的二抗；所述的酶标二抗的浓度优选为0.5μg/mL；稀释所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药物筛选方法，其特征在于，基于在病理机制中相互作用的第一蛋白质和第二蛋白质进行构建，包括如下步骤：(1)通过本领域常规方式获得保持活性的第一蛋白质‑第一蛋白标签融合蛋白与第二蛋白质‑第二蛋白标签融合蛋白，所述的第一蛋白标签与第二蛋白标签不相同；(2)以ELISA常规包被方法对第一标签抗体进行包被后，洗板，然后进行封闭处理；(3)加入第一蛋白质‑第一蛋白标签融合蛋白进行孵育，洗板；(4)加入与第二蛋白质‑第二蛋白标签融合蛋白以及待筛选药物进行孵育，洗板；(5)加入与所述的第一标签抗体的来源属性不同第二标签抗体进行孵育，洗板；(6)加入能够结合第二标签抗体的酶标二抗进行孵育；(7)加入显色液，充分显色后立即加入终止液终止显色；(8)待显色稳定后进行双波长测定，按照OD450‑OD630计算每个孔的吸光度值，分析待筛选药物对第一蛋白质和第二蛋白质相互作用的影响程度。

【技术特征摘要】
1.一种药物筛选方法，其特征在于，基于在病理机制中相互作用的第一蛋白质和第二蛋白质进行构建，包括如下步骤：(1)通过本领域常规方式获得保持活性的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白与第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白，所述的第一蛋白标签与第二蛋白标签不相同；(2)以ELISA常规包被方法对第一标签抗体进行包被后，洗板，然后进行封闭处理；(3)加入第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白进行孵育，洗板；(4)加入与第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白以及待筛选药物进行孵育，洗板；(5)加入与所述的第一标签抗体的来源属性不同第二标签抗体进行孵育，洗板；(6)加入能够结合第二标签抗体的酶标二抗进行孵育；(7)加入显色液，充分显色后立即加入终止液终止显色；(8)待显色稳定后进行双波长测定，按照OD450-OD630计算每个孔的吸光度值，分析待筛选药物对第一蛋白质和第二蛋白质相互作用的影响程度。2.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于：当所述的第一蛋白质为CDK1时，所述的第二蛋白质为KCTD12；当所述的第一蛋白质为c-Raf1，所述的第二蛋白质为PHB1；所述的药物为治疗癌症的药物。3.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于：步骤(2)中所述的第一标签抗体的浓度为1ng/μL；所述的第一标签抗体用ELISA包被液进行稀释；步骤(3)中所述的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白的初始浓度为1～4mg/mL；步骤(3)中所述的第一蛋白质-第一蛋白标签融合蛋白在每孔中的终浓度为5～20μg/mL；步骤(4)中所述的第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白的初始浓度为1～4mg/mL；步骤(4)中所述的第二蛋白质-第二蛋白标签融合蛋白在每孔中的终浓度为5～20μg/mL；步骤(5)中所述的第二标签抗体的浓度为0.5μg/mL；步骤(6)中所述的酶标二抗的浓度为0.5μg/mL。4.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于：所述的药物为小分子药物；步骤(1)所述的第一蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：何庆瑜，杨杰，李斌，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44