本发明专利技术提供一种马铃薯渗透胁迫下泛素化修饰蛋白筛选方法，包括：（1）茎尖脱毒组培苗繁育及分组与胁迫处理；（2）泛素（Ub）和26S蛋白酶体（26S）表达量测定并确定取样时间；（3）蛋白质样品制备；（4）蛋白样品胰酶酶解；（5）泛素化肽段富集；（6）LC‑MS/MS分析；（7）质谱数据分析。该方法能够准确并最大限度的筛选出马铃薯渗透胁迫下泛素化修饰蛋白，共得渗透胁迫下差异泛素化修饰位点25个，这些显著变化的泛素化修饰蛋白与渗透胁迫响应有关，因此本申请所述筛选泛素化修饰蛋白的方法对发现响应渗透胁迫的基因和阐明泛素化修饰参与渗透胁迫的机制具有重要意义和显著进步。
【技术实现步骤摘要】
渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法
本专利技术属于分子遗传育种领域，提供了马铃薯渗透胁迫下泛素化修饰蛋白筛选方法。
技术介绍
马铃薯（SolanumtuberosumL.）属于茄科块茎作物，发源于安第斯山脉，具有很高的经济价值。人类驯化并种植马铃薯已有8000多年的历史。2016年世界粮农组织（FAO）的统计资料显示，马铃薯全球种植面积达到19,246,462公顷，年产量376,826,967吨（http://www.fao.org/home/en/），仅次于玉米、小麦和水稻，属于第四大粮食作物。截止2018年5月全球共有163个国家种植马铃薯（http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC），且种植面积近年来持续增加，许多贫困地区居民的粮食和营养主要来源于马铃薯。马铃薯也是一种理想的食品，含有丰富的淀粉、蛋白质、维生素C、B族维生素、矿物质、β-胡萝卜素、有机酸等营养物质，马铃薯还广泛用作工业原料和燃料生产。泛素-蛋白酶体系统是最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径，也是重要的蛋白质翻译后修饰方式，研究表明泛素化系统参与调控非生物胁迫等众多生理过程。泛素化系统在植物的胁迫应答中的广泛作用表明泛素化修饰的靶蛋白可能是响应各种胁迫信号通路中的关键蛋白，因此，系统的筛选马铃薯泛素化修饰蛋白，特别是干旱胁迫下泛素化修饰差异蛋白，这对揭示泛素化修饰参与马铃薯干旱胁迫中的生理作用具有重要意义。现有技术存在的问题：现有技术中未见渗透胁迫下泛素化修饰蛋白筛选方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了马铃薯渗透胁迫下泛素化修饰蛋白筛选方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：马铃薯渗透胁迫下泛素化修饰蛋白筛选方法，包括以下步骤：（1）茎尖脱毒组培苗繁育及分组与胁迫处理；（2）泛素（Ub）和26S蛋白酶体（26S）表达量测定并确定取样时间；（3）蛋白质样品制备；（4）蛋白样品胰酶酶解；（5）泛素化肽段富集；（6）LC-MS/MS分析；（7）质谱数据分析。附图说明图1为马铃薯泛素（Ub）和26S蛋白酶体（26S）表达量随时间变化趋势。图2-图3为25个马铃薯渗透胁迫下差异泛素化修饰位点。图4-图12为340个马铃薯渗透胁迫下泛素化修饰位点。具体实施方式为使专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本专利技术的实施方式仅仅是示例性的，并且本专利技术并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本专利技术的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本专利技术的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。实施例1马铃薯渗透胁迫下泛素化修饰蛋白筛选方法，具体包括如下步骤：1.茎尖脱毒组培苗繁育及分组与胁迫处理马铃薯栽培品种“Atlantic”块茎自冷库中取出，室温下避光放置30d使其发芽。待马铃薯芽长至2cm时，取其芽无菌水冲洗10min，转移至无菌锥形瓶中，采用0.1%HgCl2灭菌1min，转移至新的无菌锥形瓶中，75%乙醇灭菌5min，再转移至新的无菌锥形瓶中，0.05%NaClO灭菌15min，无菌水冲洗3遍，最后用灭菌的剪刀剪去芽的底部，转移到固体MS培养基上，20℃光照（2000lx，16h/d）培养20d。待芽初次分化出幼苗时剪取茎段转接到新的MS培养基上，光照培养待用。取马铃薯组培苗含有两叶片的茎段转接到无菌液体MS培养基中培养，待植株长至6cm高时随机分成8组，每组6瓶，其中7组更换含有20％PEG6000的MS培养液，并于0、2、4、6、8、12、16和24h后收集每组中3瓶试管苗鲜叶，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存用于RNA提取，另外3瓶试管苗植株用蒸馏水冲洗5遍，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存用于蛋白质提取。2.泛素（Ub）和26S蛋白酶体（26S）表达量测定并确定取样时间（1）取马铃薯叶片100mg，采用实施例2所述的方法提取马铃薯总RNA，并用微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，取OD260/280位于1.9-2.1之间的RNA样品用于后续实验。（2）上述RNA样品置于碎冰中缓慢解冻，TIANGENFastQuantRT试剂盒室温下解冻后涡旋混匀，再置于碎冰中。（3）取上述经DEPC处理的微量离心管加入RNA2μg（根据浓度计算得到相应体积）、5×gDNABuffer2μL、RNaseFreeddH2O补足至20μL。置于PCR仪上42℃反应3min，使样品中的DNA充分水解。（4）取出上述离心管加入10×FastRTBuffer2μL、RTEnzymeMix1μL、FQ-RTPrimerMix2μL、RNaseFreeddH2O补足至20μL。置于PCR仪上42℃反应15min，95℃变性3min。取出逆转录得到的cDNA稀释10倍用于后续qRT-PCR。（5）从马铃薯基因组数据库（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中获取Ub转录本序列（PGSC0003DMT400089149）、26S蛋白酶体RPT4a亚基转录本序列（PGSC0003DMT400079514）和内参基因EF1α转录本序列（PGSC0003DMT400059830）；利用NCBIPrimer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线工具在CDS区设计引物，并由上海生工合成。Ub-F:TTACCCTTGAGGTCGAAAGC，Ub-R:TTCCAACTGTTTCCCTGCAA；26S-F:AGGTATGTGGTTGGCTGTCG，26S-R:GGATCAACTTCACGGGGGAGEF1α-F:GATGGTCAGACCCGTGAACA，EF1α-R:CCTTGGAGTACTTCGGGGTG。（6）qRT-PCR反应之前先进行PCR反应，以验证引物特异性。在微量离心管中加入2×MasterMix10μL、引物各0.6μL（10μmol/μL）、模板cDNA1.0μL、ddH2O7.8μL。PCR反应条件：94℃预变性40s；94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸20s，38个循环；最后72℃延伸10min；产物经1%琼脂糖电泳检测。（7）TIANGENSuperRealPreMixPlus试剂盒在碎冰中解冻。在96孔板中加入2 ×SuperRealPremix10μL、50 ×ROXReferenceDye0.4μL、引物各0.6μL（10μmol/μL）、模板cDNA1.0μL，ddH2O补足至20μL。qRT-PCR反应在StratageneMx3005荧光PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性40s；94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸20s，38个循环；最后72℃延伸10min。每个cDNA样品设置3个技术重复，收集各反应Ct值，Ub和26S相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。数据处理和标准差计算采用Excel2016，差异显著性分析采用SPSS17.0统计软件Duncan's新复本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.马铃薯渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）茎尖脱毒组培苗繁育及分组与胁迫处理；（2）泛素和26S蛋白酶体表达量测定并确定取样时间；（3）蛋白质样品制备；（4）蛋白样品胰酶酶解；（5）泛素化肽段富集；（6）LC‑MS/MS分析；（7）质谱数据分析。
【技术特征摘要】
2018.07.24 CN 20181081532681.马铃薯渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）茎尖脱毒组培苗繁育及分组与胁迫处理；（2）泛素和26S蛋白酶体表达量测定并确定取样时间；（3）蛋白质样品制备；（4）蛋白样品胰酶酶解；（5）泛素化肽段富集；（6）LC-MS/MS分析；（7）质谱数据分析。2.根据权利要求1所述的马铃薯渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）泛素和26S蛋白酶体表达量测定并确定取样时间，具体取样时间为渗透胁迫处理后8h。3.根据权利要求1所述的马铃薯渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法，其特征在于，所述步骤（3）蛋白质样品制备包括：（1）取马铃薯试管苗各3株在液氮中用研钵磨碎成细粉状，将细粉加入离心管并加入5倍体积1:9混合的三氯乙酸和丙酮，震荡混匀，置于-20℃冰箱中沉淀4h；（2）4℃6000r/min离心40min，弃去上清，加入碎冰中预冷的丙酮重悬，再离心洗涤3次，超净工作台中干燥；（3）称取20-30mg干燥后的粉末，加入30倍体积的UA裂解液，涡旋混匀并重新沉淀；（4）冰浴中超声破碎，14000r/min离心40min，取上清采用0.22µm滤膜过滤，收集滤液；（5）蛋白质定量；（6）取各样品蛋白质20µg分别加入5×LoadingBuffer，沸水浴5min，然后采用12.5%SDS-PAGE14mA电泳90min。4.根据权利要求1所述的马铃薯渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法，其特征在于，所述步骤（4）蛋白样品胰酶酶解包括：（1）取各组蛋白质样品分别加入二硫苏糖醇至终浓度为10mmol/L，置于37℃摇床中600r/min，1.5h，取出冷却至室温，加入碘乙酰胺至终浓度50mmol/L，室温避光反应40min；（2）加入4倍体积50mmol/LTris-HCl，采用25mmol/LNH4HCO3缓冲液稀释4倍，白酶（Trypsin）质量比50:1加入胰蛋白酶，37℃酶切15-...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐勋，司怀军，张宁，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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