一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法技术

本发明专利技术属于分子生物鉴定方法技术领域，特别涉及一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法，包括采集待鉴定牛肉样品并提取DNA样品，设计特异性引物并对待鉴定样品进行PCR扩增，对扩增后的产物用琼脂糖凝胶进行电泳，对比电泳结果判断牛肉种类。本发明专利技术提供了一种简便、快捷、高效、准确的牛肉种类鉴定方法，成本低，具有应用前景。

A Method for Rapid Identification of Yak, Yellow Cattle and Calf

The invention belongs to the technical field of molecular biological identification, in particular to a method for rapidly identifying yak, cattle and beef. It includes collecting and identifying DNA samples, designing specific primers, and amplifying PCR. The invention provides a simple, fast, efficient and accurate beef species identification method with low cost and application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法
本专利技术属于分子生物鉴定方法
，特别涉及一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法。
技术介绍
当下肉制品市场鱼龙混杂，肉制品掺假给肉制品质量市场监管提出了很大的难度和要求。肉制品掺假例如有以猪肉冒充羊肉或牛肉，以鸭肉、鸡肉、更有甚者以老鼠肉来充当价格更高的牛羊肉，这不仅仅关系到消费者健康而且也关系到宗教信仰等问题，不明来源的消费者的健康因此面临着巨大的威胁。牛肉是广大消费者比较喜欢的肉类，尤其是在青海、新疆、西藏等牛肉消费量大的省市。然而，由于饮食习惯，对于不同的牛肉人们也有偏好性，牦牛因为其生活多在寒冷的牧区，且大部分已放牧为主，所以其绿色、有机的环境受到众多消费者的亲睐，餐饮市场牦牛肉销售异常火爆，这就有人从中作假，以普通牛肉(例如黄牛肉、犏牛肉)充当牦牛肉，欺骗广大消费者。目前，常见而且有效的肉类鉴定方法有感官检测进行鉴定如：色泽、纤维粗细等，这种鉴定方法需要鉴定人员具有丰富的经验且并准确度低；另一种就是通过对特定的DNA片段进行扩增，对目的条带进行回收、酶切、电泳检测鉴定，步骤要稍加繁琐。为此，我们针对黄牛、犏牛、犏牛肉研究了一种简单快速鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种简便、快捷、高效、准确的牛肉种类鉴定方法，成本低，具有应用前景。本专利技术提供了一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法，包括以下步骤：S1，提取DNA样品；S2，设计特异性引物并对待鉴定样品进行PCR扩增；其中，所述特异性引物序列为：F：5’-tgctctctggccttctccagtcagaa-3’，R：5’-gctgcagtaattctcctgtgac-3’；S3，对扩增后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶在110V下电泳30-35min，对比电泳结果判断牛肉种类；当片段大小为962bp时，样品为牦牛；当片段大小为1047bp时，样品为黄牛；当片段大小为962bp、1047bp两种时，样品为犏牛。优选地，上述提取DNA样品的步骤具体如下：S11，收集待鉴定牛肉样品，依次加入细胞裂解液和20mg/mL的蛋白酶K，56℃消化过夜，得消化溶液；S12，加入相当于S11消化溶液等体积的Tris饱和酚，混匀，12000r/min离心10min，保留上清液，然后加入相当于上清液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇三者混合溶液，混匀，12000r/min离心10min，保留上清液，其中，苯酚、氯仿和异戊醇三者的体积比为25：24：1；S13，S12上清液中加入氯仿，混匀，12000r/min离心10min，保留上清液并加入相当于2倍体积的冷乙醇，分离出沉淀并用75％乙醇洗涤，12000r/min离心10min，取沉淀晾干，得固体DNA样品；S14，S13中固体DNA样品加ddH2O或TE溶解，调整到500ng/μL。优选地，所述细胞裂解液的组成为：12mL的150mmol/L的Tris-HCl、36mL的0.5mmol/L的EDTA、9mL的10％SDS溶液混合，加水定容至180mL。优选地，所述待检牛肉样品、细胞裂解液、蛋白酶K、S13中氯仿的用量比为：1g：1400μL：40μL：1000μL。优选地，所述PCR扩增体系为：Mix溶液5μL，两条引物序列溶液各0.5μL，引物序列溶液浓度均为10μmol/L，样品DNA模板0.5μL，ddH2O补足10μL。优选地，所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共30次循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种简便、快捷、高效、准确的牛肉种类鉴定方法，简单易行，大大提高了检测的速度与准确性，且成本低，在家畜养殖、食品安全等领域均具有应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1的电泳结果图。具体实施方式下面结合附图1对本专利技术的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例1一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法，包括以下步骤：S1，提取DNA样品；S11，收集0.5g待鉴定牛肉样品，尽可能地剪碎，依次加入700μL细胞裂解液和20μL的20mg/mL的蛋白酶K，56℃消化过夜(超过12h)，得消化溶液；细胞裂解液的组成为：12mL的150mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、36mL的0.5mmol/L的EDTA(pH8.0)、9mL的质量浓度10％SDS溶液混合，加水定容至180mL；其中，EDTA配制为：800mL水加入186.12gEDTA.2Na.2H2O，磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH至8.0，然后加水定容至1L，分装后高压灭菌备用；10％SDS溶液配制为：900mL水加入100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节pH至7.2，然后加水定容至1L，分装备用，无需灭菌。S12，加入相当于S11消化溶液等体积的Tris饱和酚，上下颠倒混匀10min，12000r/min离心10min，保留上清液，然后加入相当于上清液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇三者混合溶液，颠倒混匀，12000r/min离心10min，保留上清液，其中，苯酚、氯仿和异戊醇三者的体积比为25：24：1；S13，S12上清液中加入500μL氯仿，上下颠倒混匀10min，12000r/min离心10min，保留上清液并加入相当于2倍体积的冷乙醇(100％乙醇冰浴)，分离出沉淀并用75％乙醇洗涤，12000r/min离心10min，取沉淀晾干，得固体DNA样品；S14，S13中固体DNA样品加ddH2O或TE缓冲液溶解，取1μL点样电泳，检查DNA的提取效果，调整到500ng/μL；S2，设计特异性引物并对待鉴定样品进行PCR扩增；其中，特异性引物序列为：F：5’-tgctctctggccttctccagtcagaa-3’，如SEQIDNO.1所示；R：5’-gctgcagtaattctcctgtgac-3’，如SEQIDNO.2所示；PCR扩增体系为：Mix溶液5μL，两条引物序列溶液各0.5μL，引物序列溶液浓度均为10μmol/L，样品DNA模板0.5μL，ddH2O补足10μL；PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共30次循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保存；S3，对扩增后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶在110V下电泳30min，对比电泳结果判断牛肉种类。牦牛的片段大小为962bp；黄牛的片段大小为1047bp；犏牛有962bp、1047bp两条带。图1为实施例1的电泳结果图，从图中可知1、2、3泳道为牦牛；4、5、6泳道为黄牛；7、8、9泳道为犏牛。实施例2一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法，包括以下步骤：S1，提取DNA样品；收集0.5g待鉴定牛肉样品，按照参考文献：鲍毅新，孙波，张龙龙，对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测.浙江师范大学学报：自然科学版2009的方法获得固体DNA样品；将固体DNA样品加ddH2O或TE缓冲液溶解，取1μL点样电泳，检查DNA的提取效果，调整到500ng/μL；S2，设计特异性引物并对待鉴定样品进行P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取DNA样品；S2，设计特异性引物并对待鉴定样品进行PCR扩增；其中，所述特异性引物序列为：F：5’‑tgctctctggccttctccagtcagaa‑3’，R：5’‑gctgcagtaattctcctgtgac‑3’；S3，对扩增后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶在110V下电泳30‑35min，对比电泳结果判断牛肉种类；当片段大小为962bp时，样品为牦牛；当片段大小为1047bp时，样品为黄牛；当片段大小为962bp、1047bp两种时，样品为犏牛。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取DNA样品；S2，设计特异性引物并对待鉴定样品进行PCR扩增；其中，所述特异性引物序列为：F：5’-tgctctctggccttctccagtcagaa-3’，R：5’-gctgcagtaattctcctgtgac-3’；S3，对扩增后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶在110V下电泳30-35min，对比电泳结果判断牛肉种类；当片段大小为962bp时，样品为牦牛；当片段大小为1047bp时，样品为黄牛；当片段大小为962bp、1047bp两种时，样品为犏牛。2.如权利要求1所述的快速鉴定牦牛、黄牛、犏牛肉的方法，其特征在于，提取DNA样品的步骤具体如下：S11，收集待鉴定牛肉样品，依次加入细胞裂解液和20mg/mL的蛋白酶K，56℃消化过夜，得消化溶液；S12，加入相当于S11消化溶液等体积的Tris饱和酚，混匀，12000r/min离心10min，保留上清液，然后加入相当于上清液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇三者混合溶液，混匀，12000r/min离心10min，保留上清液，其中，苯酚、氯仿和异戊醇三者的体积比为25：24：1；S13，S12上清液中加入氯仿，混匀，12000r/min离心1...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾功雪，王国文，张瑞娜，朱青云，杨其恩，李永元，保万秀，赵海梅，郭全辉，盛加海，杜永忠，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海,63