LEPTO1及其编码蛋白在水稻育性控制中的应用制造技术

本发明专利技术公开了LEPTO1蛋白及其编码基因在调控植物雄性育性中的应用。本发明专利技术提供了抑制LEPTO1蛋白活性和/或水平的物质在培育雄性不育植物中的应用；或抑制或降低LEPTO1蛋白编码基因表达的物质在培育雄性不育植物中的应用。本发明专利技术的发明专利技术人，通过CRISPR‑Cas9基因编辑技术在野生型水稻中敲除该基因可以造成花粉母细胞的发育停滞在前细线期，并导致染色体降解及最终的花粉败育。结合采用组织特异性基因敲除技术定点突变LEPTO1蛋白编码基因可以用于水稻育性控制和杂交种子生产，因此本发明专利技术在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量、提高水稻品质提供重要生物资源。

Application of LEPTO1 and its coding protein in rice fertility control

The invention discloses the application of LEPTO1 protein and its coding gene in regulating plant male fertility. The invention provides the application of substances that inhibit the activity and/or level of LEPTO1 protein in breeding male sterile plants, or substances that inhibit or reduce the expression of LEPTO1 protein coding gene in breeding male sterile plants. The inventor of the present invention, by using CRISPR Cas9 gene editing technology, knocking out the gene in wild-type rice can cause the development of pollen mother cells to stagnate in the pre-fine line stage, and lead to chromosome degradation and final pollen abortion. The LEPTO1 protein coding gene with site-directed mutation by tissue-specific gene knockout technique can be used for fertility control and hybrid seed production in rice. Therefore, the present invention has great significance in rice breeding and can provide important biological resources for increasing rice yield and improving rice quality.

【技术实现步骤摘要】
LEPTO1及其编码蛋白在水稻育性控制中的应用
本专利技术属于生物
，尤其LEPTO1及其编码蛋白在水稻育性控制中的应用。
技术介绍
水稻是全球最重要的粮食作物之一，世界上近半数的人口都以水稻为食。水稻是我国的第一大粮食作物，因此如何提高水稻的产量是我国农业生产上的关键问题。随着世界人口增加、耕地面积减少和气候条件恶化等因素的影响，人类对水稻产量增加的要求日益凸显。在两次“绿色革命”中，水稻的单产得到了突破性的增长。第一次“绿色革命”发生在20世纪中期，最主要的特征是把水稻的高杆变成矮杆，随着矮杆品种的推广，水稻产量有了很大幅度的提高，解决了很多国家的粮食自给问题。第二次绿色革命发生在20世纪下半叶，我国的杂交水稻是第二次绿色革命的杰出代表。杂交水稻充分利用了水稻的杂种优势，使水稻产量实现了飞跃性的提高，为全世界创造了巨大的经济效益。杂交水稻是通过三系选育法来培育的。三系包括雄性不育系，保持系和恢复系。雄性不育系是指雄性退化但是雌蕊正常的水稻。只有依靠外来花粉才能受精结实。保持系是雌雄蕊都能正常发育的水稻，保持系的特点是用它的花粉给不育系授粉后所产生的后代依然是不育的。恢复系也是雌雄蕊都可以正常发育的水稻，恢复系的特点是用它的花粉给不育系授粉后所产生的杂交种雄蕊的发育恢复正常并且可以自交结实。三系选育法培育杂交水稻的关键是寻找合适的雄性不育系。但是自然界的雄性不育植株极少并且鉴定困难。因此，通过基因工程途径获得雄性不育系是杂交育种的一个重要方向。减数分裂是真核生物形成配子时进行的DNA复制一次细胞分裂两次的一种特殊的分裂方式。通过减数分裂产生染色体数目减半的配子，再通过受精作用使染色体加倍维持染色体数目的稳定性。减数分裂起始后的一个重要事件就是细线期的形态建成。目前为止，在水稻中共克隆到了两个参与水稻细线期形成的基因MEL1和MEL2。近年来，以CRISPR-Cas9为代表的基因编辑技术的蓬勃发展使基因的定点编辑技术成为可能。由于具有简便高效的特点，已经广泛运用于动植物的基因编辑。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供抑制LEPTO1蛋白活性和/或含量的物质的应用。本专利技术提供了抑制LEPTO1蛋白活性和/或水平的物质在培育雄性不育植物中的应用；本专利技术还提供了抑制或降低LEPTO1蛋白编码基因表达的物质在培育雄性不育植物中的应用；所述LEPTO1蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；(c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。上述应用中，所述物质为CRISPR-Cas9系统，该系统表达Cas9蛋白的基因和sgRNA的基因，所述sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。该系统可以为载体，Cas9蛋白的基因和sgRNA的基因可以在同一个载体，也可以在不同的载体。本专利技术的另一个目的是提供一种培育雄性不育植物的方法。本专利技术提供了一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中LEPTO1蛋白编码基因的表达，得到雄性不育植物；所述LEPTO1蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；(c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。所述LEPTO1蛋白编码基因为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：1)编码区如序列表中序列1第351-2231位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)来源于水稻的与1)或2)限定的DNA序列具有98％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；5)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。本专利技术还保护一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：降低或抑制目的植物中LEPTO1蛋白的活性和/或含量，得到雄性不育植物；所述LEPTO1蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；(c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。上述中，降低或抑目的植物中LEPTO1蛋白的表达或活性；或抑制目的植物中LEPTO1蛋白编码基因的表达均采用CRISPR-Cas9定点突变LEPTO1蛋白编码基因，其中，CRISPR-Cas9定点突变中，sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。CRISPR-Cas9定点突变LEPTO1蛋白编码基因的实现方式为在目的植物中导入重组质粒；所述重组质粒中具有表达Cas9蛋白的基因和表达sgRNA的基因，sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。在专利技术的实施例中，重组质粒为pCAMBIA1300-cas9-gRNA，该质粒为在pCAMBIA1300-cas9载体的多克隆位点(例如BamHI和KpnI酶切位点之间)插入序列表的序列3所示的DNA分子得到的重组质粒，该质粒表达sgRNA,sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。本专利技术还保护一种sgRNA，其靶序列如序列表的序列4所示。本专利技术还保护一种重组质粒，所述重组质粒中具有表达Cas9蛋白的基因和表达sgRNA的基因，sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。所述重组质粒具体可为重组质粒pCAMBIA1300-cas9-gRNA。重组质粒pCAMBIA1300-cas9-gRNA为：在pCAMBIA1300-cas9载体的多克隆位点(例如BamHI和KpnI酶切位点之间)插入序列表的序列3所示的DNA分子得到的重组质粒。本专利技术还保护一种蛋白质(LEPTO1蛋白)，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；(c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。编码LEPTO1蛋白的核酸分子也属于本专利技术的保护范围，其具体为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：1)编码区如序列表中序列1第351-2231位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)来源于水稻的与1)或2)限定的DNA序列具有98％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；5)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。本专利技术还保护以上任一所述方法、所述蛋白质、所述核酸分子、所述sgRNA或所述重组质粒在植物育种中的应用。以上任一所述雄性不育体现为所有花粉完全败育。以上任一所述植本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抑制LEPTO1蛋白活性和/或含量的物质在培育雄性不育植物中的应用；或抑制或降低LEPTO1蛋白编码基因表达的物质在培育雄性不育植物中的应用；所述LEPTO1蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；(c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.抑制LEPTO1蛋白活性和/或含量的物质在培育雄性不育植物中的应用；或抑制或降低LEPTO1蛋白编码基因表达的物质在培育雄性不育植物中的应用；所述LEPTO1蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；(c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为CRISPR-Cas9系统，所述CRISPR-Cas9系统表达Cas9蛋白的基因和sgRNA的基因，所述sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。3.一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：降低或抑制目的植物中LEPTO1蛋白的活性和/或含量，得到雄性不育植物；所述LEPTO1蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋白质；(c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。4.一种培育雄性不育植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中LEPTO1蛋白编码基因的表达，得到雄性不育植物：所述LEPTO1蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)来源于水稻且与(a)具有98％以上同一性...

【专利技术属性】
技术研发人员：程祝宽，赵婷婷，李亚非，唐丁，沈懿，杜桂杰，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11