本发明专利技术公开了自噬调节剂在消除牛乳腺上皮细胞内金黄色葡萄球菌中的应用。本发明专利技术首次对金黄色葡萄球菌与牛乳腺上皮细胞自噬之间的关系进行了研究，发现金黄色葡萄球菌能够诱导牛乳腺上皮细胞自噬，但不能被自噬清除。因此，清除侵入牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌极为困难。本发明专利技术意外的发现，自噬调节剂‑‑氯喹(CHQ)能够在自噬后期使牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌数量大幅降低，因此，CHQ可以被开发成为清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物，以及治疗牛乳腺炎的药物，具有十分重要的应用价值。
Application of Autophagy Regulator in Eliminating Staphylococcus aureus in Bovine Mammary Epithelial Cells
The invention discloses the application of autophagy regulator in eliminating Staphylococcus aureus in bovine mammary epithelial cells. The relationship between Staphylococcus aureus and autophagy of bovine mammary epithelial cells was studied for the first time. It was found that Staphylococcus aureus could induce autophagy of bovine mammary epithelial cells, but could not be eliminated by autophagy. Therefore, it is extremely difficult to remove Staphylococcus aureus invading bovine mammary epithelial cells. The invention unexpectedly finds that the autophagy regulator
【技术实现步骤摘要】
自噬调节剂在消除牛乳腺上皮细胞内金黄色葡萄球菌中的应用
本专利技术涉及医药用途领域，具体涉及自噬调节剂在消除牛乳腺上皮细胞内金黄色葡萄球菌中的应用。
技术介绍
牛乳腺炎是乳制品行业中非常普遍的疾病，并且在世界上许多国家和地区造成了相当大的损失(Tollersrudetal.,2000)。细菌，真菌，支原体和藻类等多种生物被认为是乳腺炎的病原体(Batavanietal.,2007)，其中细菌是最主要的病原(StuhrandAulrich,2010)。根据各病原体的特征，乳腺炎病原体可分为传染性和环境性的(Merrimanetal.,2014)。金黄色葡萄球菌被认为是乳腺炎最主要的传染性病原体之一(Francozetal.,2012)。它能在乳腺内存活和繁殖，并能引起持续性感染，引发炎症反应，导致牛间传播。持续性的乳房内感染一般表现为体细胞计数的长期增加和临床病例的反复出现，导致金黄色葡萄球菌性乳房炎变得更难以从牛群中消除(Scaccabarozzietal.,2011).之前研究表明金黄色葡萄球菌可以入侵乳腺上皮细胞(BMECs)，从而逃避免疫防御机制并从BMECs中存活(Mestreetal.,2010；Schnaithetal.,2007；SinhaandFraunholz,2010)。自噬是一种高度保守的机制，通过去除受损的细胞器和胞质蛋白来维持体内平衡(KtistakisandTooze,2016)。过程可以提供必要的营养物和大分子以应对饥饿。除此之外，自噬也可以在许多条件下触发，包括氧化应激，缺氧和辐射(Kimetal.,2018)。到目前为止，已经描述了三种类型的自噬，巨自噬，微自噬和分子伴侣介导的自噬。(Satoetal.,2016)。其中，巨自噬涉及细胞内组分的隔离(Morissetteetal.,2010)，例如蛋白质聚集体，细胞器，以及病原体。然后携带载体的囊泡(自噬体)与溶酶体融合以降解和循环利用。近年来，大量研究表明细胞内细菌也可以通过称为食糜的过程被自噬靶向降解。(BahandVergne,2017)。细胞溶质以及液泡细菌可被自噬机器识别和捕获，从而最终靶向溶酶体。自噬受一系列信号通路和超过30种关键调节因子(自噬相关基因(Atgs))调控(Mizushimaetal.,2008；Ravikumaretal.,2010)。PI3K/Akt和ERK1/2信号通路已被证实参与调节自噬以响应于胞内病原体(Shinojimaetal.,2007)。SQSTM1/p62的泛素相关(UBA)结构域可以将泛素化的货物结合起来并将复合物引入囊泡。微管相关蛋白1轻链3(LC3)被鉴定为哺乳动物中的自噬体特异性膜制造者。当自噬进行时，LC3通过LC3相互作用区域(LIR)识别，并且磷脂酰乙醇胺共价结合至脂质-LC3(Kobayashietal.,2010)。然后膜延伸，融合并形成闭合的双膜囊泡。随后，与溶酶体融合的自噬体和货物降解(Kabeyaetal.,2000；Kabeyaetal.,2004)。先前的研究报道了由许多细胞内病原体引起的自噬特征，例如弗氏志贺氏菌，流产布鲁氏菌，伯氏疟原虫，嗜肺军团菌和牙龈卟啉单胞菌等。(OgawaandSasakawa,2006；Rodriguesetal.,2008).作为乳腺的重要屏障，乳腺上皮细胞在维持上皮细胞完整性和抵抗感染方面发挥着重要作用，但尚未探索如何通过自噬对金黄色葡萄球菌感染作出反应。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术首先研究了金黄色葡萄球菌与牛乳腺上皮细胞之间的作用关系，本专利技术发现侵入牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌可以诱导自噬，但不能被自噬清除。这使得金黄色葡萄球菌可以逃避宿主细胞(牛乳腺上皮细胞)的自噬，更增加了患有金黄色葡萄球菌-乳腺炎的奶牛的治愈难度。为寻找能够清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物，本专利技术意外的发现，通过使用自噬调节剂--氯喹(CHQ)能够在自噬后期使牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌数量大幅降低。基于此，提出下述专利技术：本专利技术的第一方面，提供自噬调节剂在制备清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物中的应用。优选的，所述自噬调节剂是CHQ。优选的，所述CHQ的浓度为20-30μM；更优选的，所述CHQ的浓度为25μM。本专利技术的第二方面，提供一种清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物，所述药物以有效量的CHQ作为活性成分。优选的，所述药物中，CHQ的浓度为20-30μM。更优选的，所述药物中，CHQ的浓度为25μM。本专利技术的第三方面，提供CHQ在制备治疗牛乳腺炎的药物中的应用。上述应用中，所述牛乳腺炎是由金黄色葡萄球菌侵入牛乳腺上皮细胞引起的。本专利技术的有益效果：本专利技术首次对金黄色葡萄球菌与牛乳腺上皮细胞自噬之间的关系进行了研究，发现金黄色葡萄球菌能够诱导牛乳腺上皮细胞自噬，但不能被自噬清除。因此，清除侵入牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌极为困难。本专利技术意外的发现，自噬调节剂--氯喹(CHQ)能够在自噬后期使牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌数量大幅降低，因此，CHQ可以被开发成为清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物，以及治疗牛乳腺炎的药物，具有十分重要的应用价值。附图说明图1：金黄色葡萄球菌诱导BMECs中的自噬体；图中，A：共聚焦显微镜下的自噬体；B：通过每个条件计数20个细胞来进行GFP-LC3斑点的定量。统计值＝(测试组-Blank1)-(治疗对照-Blank2)+空白的平均值，每个细胞的平均斑点数显示为平均值±SD，N＝3。(*，P<0.05；**，P<0.01)。图2：金黄色葡萄球菌攻击后检测LC3；图中，A：试验组中LC3I/II的变化；B：治疗对照中LC3I/II的变化；C：统计数据对LC3I/II的变化。制备细胞裂解物并使用指定的抗体通过免疫印迹分析。通过ImageJ分析LC3-I与LC3-II表达相比的标准化。上图代表性蛋白质印迹图像；下图定量分析。统计值＝(测试组xh/0h-治疗对照xh/0h)+100％(x等于0,2,4,6,8,12)。值显示为平均值±SD，N＝3。(*，P<0.05；**，P<0.01)。图3：金黄色葡萄球菌攻击后检测p62；图中，A：试验组中p62的变化；B：治疗对照中p62的变化；C：统计学对p62的变化。制备细胞裂解物并使用指定的抗体通过免疫印迹分析。用ImageJ分析GAPDH与p62表达相比的标准化。上图代表性蛋白质印迹图像；下图定量分析。统计值＝(测试组xh/0h-治疗对照xh/0h)+100％(x等于0,2,4,6,8,12)。值显示为平均值±SD，N＝3。(*，P<0.05；**，P<0.01)。图4：金黄色葡萄球菌攻击后检测mTOR；图中，A：试验组中mTOR的变化；B：治疗对照中mTOR的变化；C：统计学上mTOR的变化。制备细胞裂解物并使用指定的抗体通过免疫印迹分析。用ImageJ分析mTOR与p-mTOR表达相比的标准化。上图代表性蛋白质印迹图像；下图定量分析。统计值＝(测试组xh/0h-处理对照xh/0h)+100％(x等于0,2,4,6)。值显示为平均值±SD，N＝3。(*，P<0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.自噬调节剂在制备清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.自噬调节剂在制备清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述自噬调节剂是CHQ。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CHQ的浓度为20-30μM。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CHQ的浓度为25μM。5.一种清除牛乳腺上皮细胞内的金黄色葡萄球菌的药物，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建柱，刘永夏，耿娜，李克鑫，李克钦，邓干臻，王晓舟，刘康平，王润，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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