一种分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法技术

本发明专利技术公开一种分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法，属于家禽育种技术领域。具体方法是将矮脚品系和绿壳蛋鸡品系进行杂交；联合利用不同的分子标记进行鉴定，保留F1代绿壳蛋杂合子个体，同时携带矮脚母鸡纯合子或矮脚公鸡杂合子个体，并根据矮脚和绿壳蛋表型进行验证与再次淘汰；留种的F1公母鸡杂合子进行横交；利用分子标记进行筛选，保留F2代同时携带绿壳蛋纯合子基因型和矮脚纯合子基因型的个体，再根据矮脚和绿壳蛋表型进行鉴定与淘汰，最终获得纯种的矮脚绿壳蛋鸡品系。

A Molecular Assisted Method for Breeding Dwarf Green Shell Layer Strains

The invention discloses a method for molecular assisted breeding of dwarf green shell laying hen strains, which belongs to the technical field of poultry breeding. The specific method is to hybridize the dwarf strain with the Green-shell egg strain, identify the hybrid with different molecular markers, retain the F1 generation of Green-shell eggs, and carry the homozygote of dwarf hen or the heterozygote of dwarf hen, and verify and re-eliminate them according to the phenotype of dwarf and Green-shell eggs, cross-breed the hybrid of the retained F1 male hen, and use molecular markers to carry out cross-breeding. Screening, reserving F2 generation individuals carrying both Green-shell eggs homozygote genotype and short-foot homozygote genotype, then identifying and eliminating them according to the phenotype of short-foot and Green-shell eggs, and finally obtaining the pure strain of low-foot Green-shell eggs.

【技术实现步骤摘要】
一种分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法
本专利技术涉及家禽育种
，具体涉及一种分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法的方法及培育效果验证的方法。
技术介绍
近年来，国内外营养学家和医学家总结鸡蛋的营养价值和保健功能主要包括健脑益智、保护肝脏、防治动脉硬化、预防癌症、延缓衰老等五大方面。绿壳蛋在以上功能基础上，因其含有大量人体必不可少的维生素和矿物质及有高生物价值蛋白质，在修复人体组织、形成新的组织、消耗能量和参与复杂的新陈代谢过程等方面起着极其重要的作用。矮小鸡具有基础代谢率低、耗料少、产蛋率高、饲养密度大、适应性和抗应激强等优势及其明显的经济效益。因此，矮脚绿壳蛋鸡在绿壳蛋的基础上，不但提高了鸡的产蛋性能，又降低了饲料消耗，从而具有更大的市场需求和经济效益而被广泛应用于当代家禽业生产。利用传统的选育方法，国内外已经成功地培育了大量的畜禽品种。但是，传统育种主要凭借育种经验依据表型对后代进行选择，无法对目标基因的基因型进行直接选择。因此，选择效率和准确性较低。而利用分子标记可从DNA水平上直接鉴定个体的基因型，避免了表型推测基因型不准确等缺点。无论是对质量性状还是连续变异的数量性状，利用分子标记辅助选择可显著提高选择效率和准确性，加快育种进程。具体而言，分子标记辅助选择具有克服性状表型鉴定的困难、可在生长发育早期选择、控制同一性状的多个(等位)基因的利用、允许同时选择多个性状、性状评价和选择不具有破坏性、可提高回交育种效率等优越性。伴性矮小基因dw(dwarf)是体重、饲料报酬、产蛋性能等众多数量性状的主效基因，具有质量性状和数量性状的双重遗传性，为不完全隐性等位基因。鸡生长激素受体(GHR)基因变异导致连锁矮小鸡，由于矮小型鸡缺少生长激素受体，影响生长激素的生物功能，从而使GH依赖性基因不能正常表达。不同鸡种的变异是不同的，目前发现有三个原因可导致鸡的矮小：首先，生长激素受体(GHR)基因1.7kb片段缺失导致；第二，GHR基因外显子T354C突变导致矮小；第三，由于一个未知位点的变异导致矮小。经过研究发现，金陵矮脚鸡的成因是由于GHR基因1.7kb片段缺失导致。鸡蛋壳颜色是重要的蛋用性状，一直备受关注。鸡的绿壳性状是1号染色体上显性绿壳基因(Oocyan，O)作用的结果。鸡的绿壳基因(O)定位于1号染色体短臂上，它与内源病毒因子(ev1)及豆冠位点(P)连锁，它们在染色体上的排列顺序为P-evl-O。进一步研究发现鸡的绿壳性状是由有机阴离子转运多肽1B3基因(Solutecarrierorganican-iontransporterfamilymember1B3，SLCO1B3，位于1号染色体65319441～65338450bp)5′侧翼区插入鸟类逆转录酶病毒(EAV-HP，长度为4.2kb)所造成。当EAV-HP插入到SLCO1B3的5′侧翼区后，导致SLCO1B3基因在子宫部特异表达，从而使蛋壳颜色表现为绿壳。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种矮脚绿壳蛋鸡的快速培育方法，该专利技术方法利用分子标记辅助育种技术，采用基因聚合的选育策略，突破了常规表型选育耗时长、纯度低的缺点，可应用于同时携带矮脚和绿壳蛋性能的矮脚绿壳蛋鸡品系的快速简捷培育，以及相关品系的性能研究与生产。为实现本专利技术目的，所使用的技术方案为：一种分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法，包括以下步骤：(1)选择体型匀称、活泼健康、体重达到平均体重及以上的，并达到性成熟的公鸡和母鸡作为待选亲本，以混精方式进行杂交后，收集种蛋并孵化，获得F1代幼雏；所述公鸡表型为黄羽、白肤、矮脚、粉壳蛋；所述母鸡表型为黑羽、白肤、高脚、绿壳蛋；(2)将F1代幼雏培育至3-4周龄后，采集血液并提取基因组DNA，使用GHR和SLCO1B3基因的分子标记对F1代幼雏进行PCR检测，保留携带SLCO1B3基因杂合子基因型，同时携带GHR基因杂合子基因型的公鸡个体及GHR基因纯合子的母鸡个体；所述GHR基因的分子标记引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示；所述SLCO1B3基因的分子标记引物序列如SEQIDNO.5～SEQIDNO.7所示；(3)将步骤(2)筛选出的个体培育至9-14周龄，母鸡产蛋高峰期时，通过脚胫长度和蛋壳颜色表型验证分子筛选结果，保留同时具备矮脚及绿壳蛋的个体；(4)将步骤(3)筛选的公鸡和母鸡以混精方式横交，收集种蛋并孵化，获得F2代幼雏；(5)将F2代幼雏培育至3-4周龄后，采集血液并提取基因组DNA，使用GHR和SLCO1B3基因的分子标记对F2代幼雏进行PCR检测，保留同时携带GHR纯合子基因型和SLCO1B3纯合子基因型的个体；所述GHR基因的分子标记引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示；所述SLCO1B3基因的分子标记引物序列如SEQIDNO.5～SEQIDNO.7所示；(6)将F2代幼雏培育至9-14周龄，母鸡产蛋高峰期，通过脚胫长度和蛋壳颜色表型验证分子筛选结果，保留同时具备矮脚及绿壳蛋的个体。优选地，所述步骤(3)和(6)脚胫长度≤6cm为矮脚。优选地，所述步骤(2)和(5)的PCR反应条件为20.0μL反应体系，包括1.0UTaqDNA聚合酶、1.0μL10×buffer、50ng模板DNA、引物各3.0pmol/L、4种dNTP各2.0μmol/L；PCR反应程序为94℃预变性5min；95℃30s，58℃退火温度30s，72℃30s，共计36个循环；72℃延伸5min。优选地，所述GHR基因判定标准为：显示417bp条带为矮脚纯合子，显示417bp和217bp条带者为矮脚杂合子。优选地，所述SLCO1B3基因判定标准为：显示425bp条带者为绿壳纯合子，显示显示425bp和340bp条带者为绿壳杂合子。本专利技术还提供一种如以上所述分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法培育的矮脚绿壳蛋鸡。本专利技术所述方法包括：矮脚品系和绿壳蛋鸡品系进行杂交；联合利用不同的分子标记进行鉴定，保留F1代绿壳蛋杂合子个体，同时携带矮母鸡脚纯合子或矮脚公鸡杂合子个体，并根据矮脚和绿壳蛋表型进行验证与再次淘汰；留种的F1公母鸡杂合子进行横交；利用分子标记进行筛选，保留F2代同时携带绿壳蛋纯合子基因型和矮脚纯合子基因型的个体，再次根据矮脚和绿壳蛋表型进行鉴定与淘汰，最终获得纯种的矮脚绿壳蛋鸡品系。本专利技术使用的绿壳蛋品系母鸡为绿壳蛋杂合子或纯系个体，优选地，使用的绿壳蛋品系母鸡为绿壳蛋纯系个体，其相比于杂合子的优势在于减少的非绿壳蛋鸡个体出现，降低饲养成本和人工浪费。采集血液并提取基因组DNA(参照《分子克隆实验指南IV》,以下DNA提取相同)，先后使用矮脚和绿壳蛋性状相关基因的分子标记进行联合鉴定；于3-4周进行分子标记联合鉴定，通过提前开展检测，可以减少中间饲养费用，考虑到发育早期血液的采集可能会影响记得发育，因此进一步地优选为4周龄。本专利技术所述含DNA提取均参照《分子克隆实验指南IV》，所用试剂均为常规试剂，可购自试剂公司；步骤(2)中保留同时携带绿壳蛋纯合基因型和矮脚杂合子基因型公鸡个体或矮脚纯合子基因型母鸡个体，和步骤(5)中保留同时携带绿壳蛋和矮脚纯合基因型个体，是根据孟德尔遗传规律确定。步骤(3)和(6)中于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）选择体型匀称、活泼健康、体重达到平均体重及以上的，并达到性成熟的公鸡和母鸡作为待选亲本，以混精方式进行杂交后，收集种蛋并孵化，获得F1代幼雏；所述公鸡表型为黄羽、白肤、矮脚、粉壳蛋；所述母鸡表型为黑羽、白肤、高脚、绿壳蛋；（2）将F1代幼雏培育至3‑4周龄后，采集血液并提取基因组DNA，使用GHR和SLCO1B3基因的分子标记对F1代幼雏进行PCR检测，保留携带SLCO1B3基因杂合子基因型，同时携带GHR基因杂合子基因型的公鸡个体及GHR基因纯合子的母鸡个体；所述GHR基因的分子标记引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；所述SLCO1B3基因的分子标记引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示；（3）将步骤（2）筛选出的个体培育至9‑14周龄，母鸡产蛋高峰期时，通过脚胫长度和蛋壳颜色表型验证分子筛选结果，保留同时具备矮脚及绿壳蛋的个体；（4）将步骤（3）筛选的公鸡和母鸡以混精方式横交，收集种蛋并孵化，获得F2代幼雏；（5）将F2代幼雏培育至3‑4周龄后，采集血液并提取基因组DNA，使用GHR和SLCO1B3基因的分子标记对F2代幼雏进行PCR检测，保留同时携带GHR纯合子基因型和SLCO1B3纯合子基因型的个体；所述GHR基因的分子标记引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；所述SLCO1B3基因的分子标记引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示；（6）将F2代幼雏培育至9‑14周龄，母鸡产蛋高峰期，通过脚胫长度和蛋壳颜色表型验证分子筛选结果，保留同时具备矮脚及绿壳蛋的个体。...

【技术特征摘要】
1.一种分子辅助培育矮脚绿壳蛋鸡品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）选择体型匀称、活泼健康、体重达到平均体重及以上的，并达到性成熟的公鸡和母鸡作为待选亲本，以混精方式进行杂交后，收集种蛋并孵化，获得F1代幼雏；所述公鸡表型为黄羽、白肤、矮脚、粉壳蛋；所述母鸡表型为黑羽、白肤、高脚、绿壳蛋；（2）将F1代幼雏培育至3-4周龄后，采集血液并提取基因组DNA，使用GHR和SLCO1B3基因的分子标记对F1代幼雏进行PCR检测，保留携带SLCO1B3基因杂合子基因型，同时携带GHR基因杂合子基因型的公鸡个体及GHR基因纯合子的母鸡个体；所述GHR基因的分子标记引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示；所述SLCO1B3基因的分子标记引物序列如SEQIDNO.5～SEQIDNO.7所示；（3）将步骤（2）筛选出的个体培育至9-14周龄，母鸡产蛋高峰期时，通过脚胫长度和蛋壳颜色表型验证分子筛选结果，保留同时具备矮脚及绿壳蛋的个体；（4）将步骤（3）筛选的公鸡和母鸡以混精方式横交，收集种蛋并孵化，获得F2代幼雏；（5）将F2代幼雏培育至3-4周龄后，采集血液并提取基因组DNA，使用GHR和SLCO1B3基因的分子标记对F2代幼雏进行PCR检测，保留同时携带GHR纯合子基因型和SLCO1B3纯合子基因型的个体；所述GHR基因的分子标记引物序列如SEQIDNO.1～SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：粟永春，沈前程，翟国胜，黄雄，陈智武，
申请(专利权)人：广西金陵农牧集团有限公司，
类型：发明
国别省市：广西,45