本发明专利技术属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用专利申请。该基因CDS序列包括579bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1位-388位核苷酸为特异性核酸片段。烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8是烟草氯离子代谢的关键蛋白，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，抑制NtSLAH8基因表达后，转基因沉默植株中氯离子含量明显降低。基于此，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量改善提供了根本性的技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用
本专利技术属于烟草基因工程
，具体涉及一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8及其应用专利申请。
技术介绍
针对烟草的已有研究普遍认为，烟叶中的氯离子含量以0.3~0.8为宜，在含量达到1%时会影响阴燃持火性，进一步高于1%时会出现黑灰熄火现象；另一方面，烟叶中氯离子含量过高时会造成淀粉积累多，叶片肥厚而脆，吸湿性大，使得存放时颜色易变深，产生不良气味。总之，烟叶中氯离子含量对于烟叶质量具有较为重要的直接影响。基于烟叶中氯离子含量对烟草品质的直接影响和其重要性，部分研究人员对全国各地烟叶中氯离子含量进行了检测统计，结果表明（中国烟草总公司郑州烟草研究院，《中国烟叶质量白皮书（2015年）》）：河南2011年~2015年烤烟烟叶化学成分中氯离子含量（0.53%-0.65%）远高于全国均值（0.26%-0.30%）。此外，根据上烟集团对豫中烟区2012-2015年氯含量测定的平均值，尤其是2014年度数据（下部叶2.21%、中部叶2.09%及上部叶2.03%），豫中烟区近几年氯离子含量都远远高于全国水平。这些统计数据表明，部分地区烟叶质量不均一性、尤其是烟叶中氯离子含量的不均一性甚至偏高特点，已成为制约浓香型烟叶品质提高的瓶颈之一。为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，传统改善方式多是从栽培技术入手，通过优化田间管理措施、完善调制发酵技术来稳定和提升烟叶品质。但总体而言，这些措施并未从根本上改变这些烟叶质量偏低、工业实用性不强的局面。因而使得相关改进措施缺乏较好实用性。随着基因组学尤其是基因编辑技术的快速发展，使得人们对于烟叶中氯离子积累与相关基因之间的关系认识越来越深入。基于已有研究已经知晓的是：慢阴离子通道（SLAC）蛋白家族主要在植物阴离子（氯离子和硝酸根离子等）摄取和气孔开闭过程中起到重要作用。但由于SLAC基因家族基因较多，在不同植物中发挥功能差异较大，因而对于不同植物、不同SLAC基因的功能尚需进行进一步的研究和区分，从而能够有针对性的用于将来的植物改良。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8（SlowlyactivatingAnionChannelHomologue,SLAH），该基因所编码的烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8与Cl-的吸收转运相关，基于这一功能，可为低氯离子含量的烟草新品种奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因，该基因来源于烟草（Nicotianatabacum），其CDS序列包括579bp碱基，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；其中第1位-388位核苷酸为特异性核酸片段。PCR扩增获得所述NtSLAH8基因的方法，具体可参考如下：（1）提取烟草样品的总RNA，并反转录为cDNA备用；（2）设计扩增引物序列如下：F：5’-CGCGAGCTCGGTACCATGGTTGCAAATCCAACT-3’，R：5’-GCTCACCATGGATCCATTACGTTTAGTGAAGT-3’；以步骤（1）中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增即可。烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8蛋白，为一种离子通道蛋白，该蛋白与氯离子转运相关，包括192个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8在烟草中的应用，用于转运氯离子。所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因在烟草中的应用，将该基因沉默后，植物体内氯离子含量明显下降。用于沉默烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体，其构建方法为：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，以所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段连接到瞬时表达载体TRV上，转化大肠杆菌DH5α后，进一步经筛选、鉴定，构建获得瞬时沉默VIGS载体：TRV-NtSLAH8。所述用于沉默烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体在烟草中的应用，利用转基因技术，将该VIGS载体转化烟草植株后，用于沉默NtSLAH8基因，使得烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8基因表达量明显降低甚至无法表达，最终降低植物体中氯离子含量。一种培育低氯植物品种的方法，利用转基因技术，将所述用于沉默烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因的瞬时沉默VIGS载体转化植物体，筛选、鉴定获得瞬时沉默植株；如果利用RNAi干扰的方法，构建基因沉默载体，转化植物体，经过筛选、鉴定即可获得转基因植物新品种，转基因植物新品种中NtSLAH8基因的表达受到限制；所述待转化植物体为普通栽培烟草。本专利技术中的烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8是烟草氯离子代谢的关键蛋白，通过real-timePCR发现该NtSLAH8基因在烟草各个组织中都表达，且在烟草叶芽组织中表达相对较高。为进一步确认该蛋白功能，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，构建了沉默NtSLAH8基因的VIGS载体，转化后成功获得了抑制NtSLAH8在本氏烟草中表达的转基因沉默植株。检测结果表明，相对对照植株，转基因沉默植株中氯离子含量明显降低，降低了约38%，即：所获得的转基因沉默植株拥有氯离子含量相对对照植株明显降低的特异表型，换言之，沉默NtSLAH8基因后可以显著降低植物体内的氯离子含量。结合现有基因工程技术可以看出，利用基因沉默技术通过敲除或者沉默NtSLAH8基因后，可以明显降低植物体内的氯离子含量，基于此，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量改善提供了根本性的技术支撑。附图说明图1为不同组织器官中NtSLAH8的相对表达量；图2为沉默植株中NtSLAH8基因的相对表达量；图3为烘干后各处理组烟叶中的氯离子含量。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。生物材料：烟草材料：本氏烟草（Nicotianabenthamiana），一种商品化烟草品种；干扰载体：TRV，购自中国质粒载体菌细胞基因保藏中心；基因测序及引物合成，由上海生工提供完成；实验试剂：LATaq酶、PstI限制性内切酶，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等，购自Takara公司，In-Fusion一步法克隆试剂盒，购自clontech公司；RNA提取试剂盒，购自于GeneAnswer公司；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒，购自Roche公司；蛋白胨、酵母提取物等，购自Oxoid公司；部分试剂配方及配制方法简要说明如下：（1）LB液体培养基（1L）：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），10g氯化钠（NaCl），5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；（2）YEB液体培养基（1L）：5g牛肉浸膏（beefextract），5g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），5g蔗糖（sucros本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因，其特征在于，该基因CDS序列包括579bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1位‑388位核苷酸为特异性核酸片段。
【技术特征摘要】
1.烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8的编码基因NtSLAH8基因，其特征在于，该基因CDS序列包括579bp碱基，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；其中第1位-388位核苷酸为特异性核酸片段。2.一种PCR扩增获得权利要求1所述NtSLAH8基因的方法，其特征在于，具体步骤为：（1）提取烟草样品的总RNA，并反转录为cDNA备用；（2）设计扩增引物序列如下：F：5’-CGCGAGCTCGGTACCATGGTTGCAAATCCAACT-3’，R：5’-GCTCACCATGGATCCATTACGTTTAGTGAAGT-3’；以步骤（1）中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。3.权利要求1所述NtSLAH8基因所编码的烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8蛋白，其特征在于，该蛋白为一种离子通道蛋白，与氯离子转运相关，包括192个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.权利要求2所述烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH8在烟草中的应用，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，徐国云，卢鹏，郑庆霞，金静静，翟妞，金立锋，周会娜，许亚龙，刘萍萍，陈千思，李泽锋，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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