一种组织和细胞冻存液及其冻存方法技术

本发明专利技术涉及一种组织和细胞冻存液及其冻存方法，具体公开了一种神经细胞或组织冻存液，其包含全神经培养基，二甲基亚砜以及血清；所述全神经培养基为Neurobasal培养基、谷氨酰胺的衍生物和细胞培养添加剂的组合物。本发明专利技术冻存液可有效冻存原代神经组织，保证神经元复苏活性。本发明专利技术适用于人或小鼠等实验动物的脑神经组织冻存，也适用于其他类似神经细胞那样不易冻存的细胞组织的冻存。

【技术实现步骤摘要】
一种组织和细胞冻存液及其冻存方法
本专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种组织和细胞冻存液及其冻存方法。
技术介绍
在神经生物学研究中，原代神经元的分离培养，是基础研究及转化研究的重要研究工具，不过由于神经元细胞缺乏增殖能力，一次原代分离后，有多余组织细胞不可长时间保存等原因，限制了神经组织的充分利用，因此，若能冻存未使用多余出的神经组织，不仅可节约分离成本，也可最大的使用样本材料。细胞冻存是低温保存技术，可以使细胞暂停生长而被保存起来，需要的时候再复苏使用。从而起到细胞保种的作用。便于细胞的交换和运送。细胞冻存液中常会加入终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。目前对于各种细胞系的保存方法通常采用冻存方法保存，然而对于正常原代细胞(例如神经细胞)的保存，通常存在细胞的冻存损伤，进而导致复苏后无法继续存活或者培养效率低等问题。另一方面，对于组织样品的冻存实施难度更大，因为在冷冻过程中存在更大程度的组织细胞中冰晶形成的破坏作用。常用的组织冻存通常是进行分子生物学方面的形态表达分析，而无法获得活的原代细胞。在现有技术中，对于非癌化组织细胞的冻存液研究还很有限。
技术实现思路
基于现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种神经细胞或组织冻存液，可冻存包括人或实验动物的原代神经元组织。本专利技术一个方面提供了一种细胞或组织冻存液，其包含全神经培养基，二甲基亚砜以及血清；所述全神经培养基为Neurobasal培养基、谷氨酰胺的衍生物和细胞培养添加剂的组合物。在本专利技术的技术方案中，所述谷氨酰胺的衍生物为GlutaMAXTM，优选为100倍稀释。在本专利技术的技术方案中，所述细胞培养添加剂为B27。在本专利技术的技术方案中，各组分的比例为全神经培养基60％-80％，二甲基亚砜5％-15％，血清为15％-25％，优选为全神经培养基70％，二甲基亚砜10％，血清为20％。在本专利技术的技术方案中，全神经培养基各组分的比例为以体积计90-99％Neurobasal培养基、0.1-5％谷氨酰胺的衍生物和0.5-5％细胞培养添加剂优选为97％Neurobasal培养基、1％谷氨酰胺的衍生物和2％细胞培养添加剂。在本专利技术的技术方案中，所述的血清为选自胎牛血清、马血清、羊血清、鸡血清或血清替代物。在本专利技术的技术方案中，所述细胞或组织冻存液优选为神经细胞和组织冻存液。本专利技术另一个方面提供了一种冻存细胞或组织的方法，其包括以下步骤：1)将待冻存的组织进行分割，分割后的组织任一边长小于5mm的小块；或者将细胞进行分离；2)将步骤1)获得的分割后的组织先浸泡于海藻酸钠溶液，再置于氯化钙溶液后，形成一层海藻酸钠钙交联保护层即可；3)将步骤2)获得的保护后的组织放入权利要求1-5任一项所述细胞或组织冻存液中进行冻存。所述Neurobasal培养基为Neurobasal培养基。所述谷氨酰胺的衍生物为100倍稀释的GlutaMAXTM(100X)。所述细胞培养添加剂B27为20％B27。所述二甲基亚砜为5％-20％二甲基亚砜，优选的为10％。所述血清为5％-90％胎牛血清，优选的20％。在本专利技术的技术方案中，组织或细胞选自人体或动物体的任意组织，优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜，胚胎，所述的脑组织更优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑皮质组织；细胞选自人体或动物体的细胞，优选为脑细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞、卵细胞，子宫内膜细胞，胚胎细胞，所述脑细胞更优选为脑皮质细胞、海马细胞或胚胎期脑皮质细胞。。在本专利技术的技术方案中，冻存的组织复苏后可以进行原代分离和培养。本专利技术另一个方面提供了上述细胞或组织冻存液在组织冻存中的用途。其中，组织选自人体或动物体的组织，更优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜，胚胎，所述脑组织最优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑皮质组织。细胞选自人体或动物体的细胞，更优选为脑细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞、卵细胞，子宫内膜细胞，胚胎细胞，所述脑细胞最优选为脑皮质细胞、海马细胞或胚胎期脑皮质细胞。有益效果：(1)本专利技术提供的冻存液，可用于冻存人或实验动物的脑神经组织；冻存复苏后仍可进行原代培养，极大的提高了组织的使用效率。(2)该冻存液，也适用于其他类似神经细胞那样不易冻存的细胞组织的冻存。附图说明：图1原代分离的人胚胎期脑皮质神经元。图2MTT法检测冻存液效果，A为本专利技术所述冻存液组，B为未冻存原代培养组，C为普通冻存液组(90％血清+10％DMSO)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1冻存液制备先制备全Neurobasal培养基：Neurobasal培养基为商品化Neurobasal培养基，商品化GlutaMAXTM(100X)。商品化B27。名称含量Neurobasal培养基(Gibco公司，货号2110-3049)485毫升B27(Gibco公司，货号：12587-010)10毫升GlutaMAXTM(100X)(Gibco公司，货号：35050061)5毫升然后，以全Neurobasal培养基为基础制备本专利技术冻存液：名称含量全Neurobasal培养基7毫升FBS2毫升DMSO1毫升制备对比例冻存液名称含量FBS9毫升DMSO1毫升实施例2人流产胎儿脑组织皮质神经组织冻存在伦理委员会指导下，取人早期流产胎儿脑皮质，将组织块分割为5毫米×5毫米大小的小块，浸泡于海藻酸钠溶液后，静置1-5分钟，置于氯化钙溶液后，即形成一层海藻酸钠钙交联保护层，浸泡于本专利技术或对比例冻存液中，静置5分钟，置于程序性降温盒后，放入-80度冰箱过夜后，在液氮中长期保存。实施例3MTT法检测不同组别冻存液效果对实施例2冻存复苏后的组织细胞以及未冻存原代培养组进行MTT细胞活性检测。其中，未冻存原代培养组的制备方法为：取人早期流产胎儿脑皮质，将组织块分割为5毫米×5毫米大小的小块，0.25％胰酶消化10分钟后，含10％血清的DMEM终止消化，并吹打成单细胞后，以每平方厘米5000个细胞密度接种于96孔板，待MTT检测。MTT具体条件为，将上述3组细胞以每平方厘米5000个细胞密度，取0.1毫升加入96孔板，每组设4个平行孔，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24小时后，每孔加入MTT20微升，继续温育4小时。然后小心除去上清后，每孔加入0.15毫升二甲基亚砜，使生成的结晶完全溶解后，在自动酶标测定仪上测光密度值(波长为570纳米)。MTT法细胞活性检测结果：组别/吸光值本专利技术冻存液组未冻存原代培养组对比例冻存液组10.1660.1780.13520.170.1690.14630.170.1720.14240.1650.1820.138通过方差分析中的多重比较进行统计分析，对比可知，本专利技术冻存液组复苏后原代培养细胞的活性，其与未冻存的新鲜原代细胞活性无差异，与对比例冻存液组细胞活性具有显著性差异，表明本专利技术冻存液具有很好的冻存效果。各组别结果参见图2。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞或组织冻存液，其包含全神经培养基，二甲基亚砜以及血清；所述全神经培养基为Neurobasal培养基、谷氨酰胺的衍生物和细胞培养添加剂的组合物。

【技术特征摘要】
1.一种细胞或组织冻存液，其包含全神经培养基，二甲基亚砜以及血清；所述全神经培养基为Neurobasal培养基、谷氨酰胺的衍生物和细胞培养添加剂的组合物。2.权利要求1所述的细胞或组织冻存液，所述谷氨酰胺的衍生物为GlutaMAXTM，优选为100倍稀释。3.权利要求1-2任一项所述的细胞或组织冻存液，所述细胞培养添加剂为B27。4.权利要求1-3任一项所述的细胞或组织冻存液，各组分的比例为全神经培养基60％-80％，二甲基亚砜5％-15％，血清为15％-25％，优选为全神经培养基70％，二甲基亚砜10％，血清为20％。5.权利要求1-4任一项所述的细胞或组织冻存液，全神经培养基各组分的比例为以体积计90-99％Neurobasal培养基、0.1-5％谷氨酰胺的衍生物和0.5-5％细胞培养添加剂，优选为97％Neurobasal培养基、1％谷氨酰胺的衍生物和2％细胞培养添加剂。6.权利要求1-5任一项所述的细胞或组织冻存液，所述的血清为选自胎牛血清、马血清、羊血清、鸡血清或血清替代物。7.一种细胞或组织冻存方法，其包括以下步骤：1)将待冻存的组织进行分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张键，赵华山，薛丽，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44