膜状非均一性生物材料透明性筛选方法及脱细胞真皮基质技术

本发明专利技术公开了一种膜状非均一性生物材料透明性筛选方法，包括生物材料蔗糖脱水，OCT包埋，逐层冰冻切片以及应用分光光度计进行透光度测量等步骤。还提供了采用上述方法而获得的高透明性脱细胞真皮基质。通过本发明专利技术，可以有效地筛选出拥有最佳透明度的脱细胞真皮基质，可用于板层角膜移植，手术大夫可以在手术中应用上述基质代替现有的板层角膜基质，在治疗患者角膜疾病的同时，还可以有效地解决当下供体角膜短缺的矛盾。

【技术实现步骤摘要】
膜状非均一性生物材料透明性筛选方法及脱细胞真皮基质
本专利技术涉及医学生物材料领域，特别是一种膜状非均一性生物材料透明性筛选方法及高透明性脱细胞真皮基质。
技术介绍
人的角膜为人眼前部的一层透明的膜状结构，是构成眼部屈光系统的重要组成成分，而其功能主要取决于其光学特性。目前，由于各种角膜疾病和损伤所导致的角膜光学特性的改变已经成为人类失明的最主要原因之一，仅位于白内障之后排列第二。针对不可逆的角膜盲，当下最有效且公认的治疗方法就是同种异体角膜移植，然而我国每年角膜供体严重不足。角膜材料来源匮乏成为了限制角膜移植手术推广的最重要因素。同时，异体角膜移植所引起的免疫排斥、伦理等因素同样制约了该方法的临床应用。因此每年有大量的角膜病患者因为角膜材料短缺的问题无法得到及时的救治，从而导致视力的丧失。角膜中基质层占其全层厚度的90％以上，其主要由大量胶原纤维和少量角膜细胞构成，其胶原纤维高度的规律性和同质性使得角膜具有良好的透明性和力学特性，这使其成为最有希望通过人工制备的而获得。目前已经有多种通过生物工程技术制备的以胶原为构架的人工角膜基质材料，但已经应用于动物实验或临床的角膜基质，例如重组人角膜胶原、重组角膜细胞外基质材料、脱细胞角膜基质等都存在一系列的问题。重组角膜胶原以及重组角膜细胞外基质材料制备过程复杂、繁琐，且其力学强度差，这极大的限制了其在临床中的应用，而以猪角膜为基础制作的脱细胞角膜基质在板层角膜移植的应用上仍具有一定的伦理问题，并且具有潜在的基因整合和疾病传播等问题。综上原因，一种同种来源、经脱细胞处理的皮肤组织工程产物——脱细胞真皮基质进入人们的视野。脱细胞真皮基质是一种由真皮提取的移植组织，已被广泛用于各种修复手术，其在脱去细胞的同时保留了天然的三维胶原框架结构，胶原结构与角膜相似，可以为组织细胞重构提供良好的支架。不仅如此，脱细胞真皮基质还具有低免疫原性，既往的动物实验表明其在边缘角膜移植中与角膜组织具有良好的生物相容性，这些优势都为脱细胞真皮基质作为理想的角膜组织工程材料提供了重要支持。然而目前脱细胞真皮基质透明性较差，无法达到角膜移植的水平，主要原因在于整片的脱细胞真皮基质并不均质，其来源于真皮，而不同深度的真皮组织结构有差异，因而导致不同层次间的透明性不同，而对其进行透明性筛选可以选出透明性较好的层次，进而开发出适用于角膜移植的脱细胞真皮基质植片，但目前尚无针对该类生物材料的合理、有效的透明性筛选方法。
技术实现思路
本专利技术为解决上述相关技术中的一种或更多种不足而提出。根据本专利技术的技术方案，能够解决目前脱细胞真皮基质不同层次间均质性差，透明性不均一且没有有效的筛选方法等问题。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于对膜状非均一性生物材料进行透明性筛选的方法，该方法可以便捷、合理、有效的检测出膜状非均一性生物材料不同层次间透明性差异，从而获得高透明性脱细胞真皮基质。同时提供了一种改进型的高透明性脱细胞真皮基质，该高透明性脱细胞真皮基质具有与正常生物体角膜相似的良好透明性和力学特性，可以潜在作为板层角膜移植的材料。为实现上述目的，本专利技术提供一种膜状非均一性生物材料透明性筛选方法，包括如下步骤：包括如下步骤：1)生物材料蔗糖脱水：将一定直径的圆形膜状非均一性生物材料于一定温度下在蔗糖溶液中进行脱水；2)OCT包埋冰冻：将脱水处理后生物材料纵行放置于盛有适量OCT的离心管中包埋，将包埋后的离心管冷冻一段时间；3)逐层冰冻切片：将装有冷冻后生物材料的离心管置于冰冻切片机内，进行一定厚度的逐层切片；4)分光光度计透光度测量：将逐层切下的切片进行至少一个波长下的吸光度测量，将测量后的吸光度转换为透光率，得到各个深度切片在至少一个波长下的透光率，获得与深度一一对应的透明性分布规律，筛选出至少一个波长下透光性优异的切片，并记录该切片的深度。优选地，所述步骤4)中，将逐层切下的切片进行不同波长下的吸光度测量，将测量后的吸光度转换为透光率，得到各个深度切片在不同波长下的透光率，获得与深度一一对应的透明性分布规律，筛选出至少一个波长下透光性优异的切片，并记录该切片的深度。优选地，在前述步骤2)中的冷冻前，还包括在离心管管壁和盖子上标注生物材料包埋方向优选地，在前述步骤3)中的切片前，还包括在打开离心管的盖子后，根据离心管盖子上的位置标注，在包埋块的上表面标注生物材料包埋方向，然后取出生物材料，再根据离心管管壁上的位置标注在包埋块的侧表面再次标注包埋方向，根据标注的包埋方向将冰冻块固定在冰冻切片机的托上，然后进行切片。优选地，在前述步骤4)中的测量前，还包括预先在孔板的每个孔中加入适量的缓冲盐溶液，将逐层切下的切片置于孔板中，并使其在孔板中展平并平铺在孔板底部，而后将置有逐层切片的孔板置于分光光度计中进行不同波长下的吸光度测量。优选地，选择在波长为490nm、570nm和630nm的三个不同波长下进行透光度测量。优选地，所述步骤1)中的直径约为6mm，脱水条件为约20％蔗糖于约4℃下进行约24小时脱水。优选地，所述步骤2)中OCT的量约为离心管体积的80％，冷冻时间约为5min。优选地，还包括以下步骤，将筛选得到的切片在全部可见光波长范围350-850nm和间距10nm下进行透光率测量，将测量结果与正常角膜比较。优选地，还包括以下步骤，将筛选得到的切片进行力学性能检测：采用单轴拉伸实验，试样大小为长度5cm，宽度1cm的长条形，厚度400-400nm，拉伸速度5mm/min，采样频率10HZ，记录拉伸过程中荷载、位置、应力、应变的原始数据，得到应力-应变曲线和弹性模量-应变曲线。本专利技术还提供了一种高透明性脱细胞真皮基质，所述高透光脱细胞真皮基质的胶原组成以Ⅰ型胶原为主，在Ⅰ型胶原的间隙中散在分布少量的Ⅲ型胶原。优选地，所述高透光脱细胞真皮基质采用上述的方法获得。优选地，所述获得具体为，在所记录的切片深度周围，切下厚度范围为200-400μm的基质。优选地，所述的高透明性脱细胞真皮基质，其平均弹性模量为32.5±14.4MPa，最大弹性模量为79.9±18.7MPa，抗拉强度为20.4±4.39MPa。本专利技术还提供了所述方法和基质的应用，膜状非均一性生物材料透明性筛选方法在制备角膜修补材料的过程中，或者制备用于治疗和/或改善角膜变薄疾病的材料的过程中的应用。以及高透明性脱细胞真皮基质在制备角膜修补材料，或者制备用于治疗和/或改善角膜变薄疾病的材料中的应用。本专利技术的有益效果包括但不限于：通过一系列步骤，经逐层透光度检测对生物材料不同深度的透明度变化规律进行精准的评估，并将透明性分布规律与深度一一对应，可以有效地筛选并获得拥有最佳透明度的脱细胞真皮基质，且具有较佳胶原分布、纤维分布的脱细胞真皮基质，可用于板层角膜移植，手术大夫可以在手术中应用上述基质代替现有的板层角膜基质，在治疗患者角膜疾病的同时，还可以有效的解决当下供体角膜短缺的矛盾，且该筛选方法操作简便，简单易学，需要的仪器和实验材料较少。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本专利技术。附图说明图1是膜状非均一性生物材料透明性筛选的示意图；图2筛选后的高透光脱细胞真皮基质；图3筛选后的高透光脱细胞真皮基质在不同波长下的透光率；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种膜状非均一性生物材料透明性筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1)生物材料蔗糖脱水：将一定直径的圆形膜状非均一性生物材料于一定温度下在蔗糖溶液中进行脱水；2)OCT包埋冰冻：将脱水处理后生物材料纵行放置于盛有适量OCT的离心管中包埋，将包埋后的离心管冷冻一段时间；3)逐层冰冻切片：将装有冷冻后生物材料的离心管置于冰冻切片机内，进行一定厚度的逐层切片；4)分光光度计透光度测量：将逐层切下的切片进行至少一个波长下的吸光度测量，将测量后的吸光度转换为透光率，得到各个深度切片在至少一个波长下的透光率，获得与深度一一对应的透明性分布规律，进而筛选出至少一个波长下透光性优异的切片，并记录该切片的深度。

【技术特征摘要】
1.一种膜状非均一性生物材料透明性筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1)生物材料蔗糖脱水：将一定直径的圆形膜状非均一性生物材料于一定温度下在蔗糖溶液中进行脱水；2)OCT包埋冰冻：将脱水处理后生物材料纵行放置于盛有适量OCT的离心管中包埋，将包埋后的离心管冷冻一段时间；3)逐层冰冻切片：将装有冷冻后生物材料的离心管置于冰冻切片机内，进行一定厚度的逐层切片；4)分光光度计透光度测量：将逐层切下的切片进行至少一个波长下的吸光度测量，将测量后的吸光度转换为透光率，得到各个深度切片在至少一个波长下的透光率，获得与深度一一对应的透明性分布规律，进而筛选出至少一个波长下透光性优异的切片，并记录该切片的深度。2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤4)中，将逐层切下的切片进行不同波长下的吸光度测量，将测量后的吸光度转换为透光率，得到各个深度切片在不同波长下的透光率，获得与深度一一对应的透明性分布规律，进而筛选出至少一个波长下透光性优异的切片，并记录该切片的深度。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在前述步骤2)中的冷冻前，还包括在离心管管壁和盖子上标注生物材料包埋方向；在前述步骤3)中的切片前，还包括在打开离心管的盖子后，根据离心管盖子上的位置标注，在包埋块的上表面标注生物材料包埋方向，然后取出生物材料，再根据离心管管壁上的位置标注在包埋块的侧表面再次标注包埋方向，根据标注的包埋方向将冰冻块固定在冰冻切片机的托上，然后进行切片。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学民，王岳鑫，邱伟强，刘子源，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：北京,11