一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建靶向ARID5A的KI‑T2A‑Luciferase细胞系的方法，该方法利用CRISPR/Cas9系统在基因组上ARID5A基因的3’端产生双链切口(DSBs)，在Cas9‑sgRNA组分中加入一个供体载体(Donor DNA)，该供体载体(Donor DNA)上带有靶向位点两端的同源序列，DSBs的修复会以供体载体(Donor DNA)为模板进行，进而将报告基因插入到ARID5A的3’端，获得单一稳定的HEK293‑ARID5A‑T2A‑luciferase‑KI细胞系。结果表明，该HEK293‑ARID5A‑T2A‑Luciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映该细胞系内ARID5A分子表达水平，有助于ARID5A基因功能研究及筛选影响ARID5A表达的上游转录因子或小分子化学药物，为与ARID5A相关的自身免疫过程及炎症反应调节的进一步研究提供了新的解决方案。

A Method of Constructing KI-T2A-Luciferase Cell Line Targeting ARID5A

The invention discloses a method for constructing a KI T2A Luciferase cell line targeting ARID5A. The method uses CRISPR/Cas9 system to generate double-stranded incisions (DSBs) at the 3'end of ARID5A gene in the genome, and adds a donor vector (Donor DNA) to the Cas9 sgRNA component. The donor vector (Donor DNA) contains homologous sequences at both ends of the targeting site, and the repair of DSBs will be used as donor vector. (Donor DNA) was used as a template, and then the reporter gene was inserted into the 3'end of ARID5A to obtain a single stable HEK293 ARID5A T2A luciferase KI cell line. The results showed that the expression level of Luciferase in HEK293 ARID5A T2A Luciferase cell line could accurately and sensitively reflect the expression level of ARID5A molecule in the cell line. It was helpful for the functional study of ARID5A gene and screening of upstream transcription factors or small molecular chemicals affecting the expression of ARID5A. It was a further study on the autoimmune process and inflammatory response regulation related to ARID5A. New solutions are provided.

【技术实现步骤摘要】
一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法
本专利技术属于分子生物学领域和药理学领域，涉及细胞系的构建，特别涉及一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法。
技术介绍
ARID5A(AT-richinteractiondomain5A)是ARID蛋白家族中的一员，具有多种功能，在发育、组织特异性基因表达和细胞生长调节中起重要作用。其中，ARID5A作为RNA结合蛋白可以通过与选择性炎症相关mRNA(例如IL6，STAT3和TBX21)的3’UTR中的茎环结构结合从而抑制mRNA降解活性，提高IL6水平，参与炎症调节反应。研究表明，这一过程可能与自身免疫过程有关。目前，基于细胞转录激活检测的报告基因系统，是建立药物筛选模型的常用手段。传统报告基因系统主要是通过将目标基因启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中来实现。但是由于基因组本身存在表观遗传学修饰，这一方法无法模拟基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因表达情况。根据申请人所进行的资料检索，到目前为止，尚没有针对ARID5A的新型报告系统，也没有更多的关于ARID5A转录调控调节和新药筛选的文献资料可以参考。所以，建立一种可以有效的对ARID5A基因的表达和调控进行监测的报告系统，不仅可以研究其转录水平的调控机制，也可以靶向筛选活性药物，这对于与炎症相关的疾病治疗有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，所构建的该靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系，可通过Luciferase表达水平来反映ARID5A分子表达水平，用于对ARID5A产生调控作用的新药筛选。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，其特征在于，按以下步骤进行：1)在目的基因ARID5A的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；2)将检测过且打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；3)构建靶向ARID5A基因的打靶载体pUC19/ARID5A-donor，该打靶载体pUC19/ARID5A-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pADNA片段；4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/ARID5A-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系。根据本专利技术，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA为针对ARID5A的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：sgRNA1序列为：GTGGGTGGGGCTGCCATTAG；sgRNA2序列为：AAGCCTGAGTTGGTCTGCGT；sgRNA3序列为：GGTGGTGGATGTAGATTTCT；sgRNA4序列为：TTGAAATCACCGGAGGTGCC。进一步地，步骤3)中所述的上下游同源臂的序列分别如下：上游同源臂序列为：CAGCTGTTCACCTCCCAGAGAGTCCCCAGAGCCCCAAAGGGCTGACTGAGAACTCCAGGCACCGGCTGACCCCTCAGGAGGGATTGCAGGCCCCAGGTGGCAGCCTCAGAGAGGAGGCGCAGGCAGGCCCCTGCCCGGCAGCCCCCATCTTCAAGGGCTGCTTCTACACCCACCCCACCGAGGTGCTGAAGCCTGTCAGCCAGCACCCCAGGGACTTCTTCTCTAGACTTAAAGATGGGGTGCTATTGGGGCCTCCTGGCAAAGAGGGGCTGTCAGTGAAAGAGCCCCAGCTGGTGTGGGGCGGAGACGCTAACCGCCCTTCTGCGTTCCATAAAGGTGGCTCCAGAAAGGGCATCCTCTACCCCAAGCCCAAAGCCTGCTGGGTGTCCCCCATGGCCAAGGTCCCAGCCGAGAGCCCCACGCTCCCGCCCACCTTCCCCAGTAGCCCAGGCCTGGGCAGCAAGCGCAGCCTGGAGGAAGAGGGTGCTGCCCACAGTGGGAAGAGACTGCGGGCCGTGTCTCCCTTTCTTAAGGAGGCGGATGCCAAGAAGTGTGGGGCCAAACCTGCAGGGTCCGGCCTGGTCTCCTGCCTTCTGGGCCCAGCCCTGGGGCCTGTGCCCCCAGAGGCCTACAGGGGCACCATGCTGCACTGCCCGCTGAACTTCACTGGCACCCCGGGCCCCTTGAAGGGCCAGGCTGCACTCCCCTTCAGCCCCCTGGTCATCCCGGCCTTCCCGGCCCACTTCCTGGCCACCGCAGGCCCCTCGCCCATGGCCGCTGGCCTGATGCACTTCCCCCCAACGTCCTTCGACAGTGCCCTCCGCCACAGACTTTGCCCGGCCTCATCTGCCTGGCACGCACCACCAGTCACAACCTATGCAGCGCCCCACTTCTTCCACCTCAACACCAAGCTG；下游同源臂序列为：GCACCACTGGAACTTACCCTGGCCGCTGGGGCTGGGATGCTCATGAACTCCGGCCATGGGAAGGGCCCCCATAGGTTGCAGGTAGAGAGGCCAAGGCCGGGGATGGGCAGGGTCTTGCTTGCCCAAGGCTACCATCCACGATGACAGAACCCAGACCAGGGAACGTGCAGCATGCCTGGCACCAGGGAGTGGGTGGCCAGGCCAAAAGGGCACCCTATCCAGCCCCTGCCCCTGGCCACCTCCTTCAGGAGCAGCCTGTGGAGGAGAGCTCAGGCACCTTCCAAGCGAGGCCTGTGACGGGTGGAGGGGCAAAGAGTGGTGCTCCCTGCTGTTGAGAGCACTCAGGCTCTGCAGGGGCATCTCCCAACCTTCCACCTCTTTCCTTCTGAGAGATGCCAAGATGTCAGCCTGAGCACCTGGAGTGACCAGCCCTGAGCTCCGCACTGCCACATGCGCCCGTGTGCAGTCCATCTCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建靶向ARID5A的KI‑T2A‑Luciferase细胞系的方法，其特征在于，按以下步骤实施：1)在目的基因ARID5A的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6‑sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；2)将检测过且打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNAs‑SV40pA；3)构建靶向ARID5A基因的打靶载体pUC19/ARID5A‑donor，该打靶载体pUC19/ARID5A‑donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A‑Luciferase‑CMV‑eGFP‑T2A‑Neomycin‑SV40pA DNA片段；4)将pCMV‑Cas9‑SV40pA‑U6‑sgRNAs‑SV40pA与pUC19/ARID5A‑donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293‑ARID5A‑T2A‑luciferase‑KI细胞系。...

【技术特征摘要】
1.一种构建靶向ARID5A的KI-T2A-Luciferase细胞系的方法，其特征在于，按以下步骤实施：1)在目的基因ARID5A的终止密码子下游设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入pU6-sgRNA1.0，筛选后获得sgRNA表达组件，并检测其打靶效率；2)将检测过且打靶效率高的sgRNA表达组件与Cas9基因克隆至一个表达载体，获得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA；3)构建靶向ARID5A基因的打靶载体pUC19/ARID5A-donor，该打靶载体pUC19/ARID5A-donor的结构为两部分，第一部分是与断裂位点上下游分别具有相同序列的上下游同源臂；第二部分是位于上下游同源臂之间的待重组入基因组靶位点的T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pADNA片段；4)将pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA与pUC19/ARID5A-donor共转HEK293细胞系，待细胞系稳定后，加1.0mg/mL的G418筛选10天，待细胞系稳定后，再加10μg/mL的GCV筛选3周，待细胞系稳定过后，对细胞经有限稀释法进行克隆化，再对克隆化后的细胞进行PCR鉴定并测序，证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在目标位点处的正确重组，最终获得单一稳定的HEK293-ARID5A-T2A-luciferase-KI细胞系。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的合成相应的sgRNA为针对ARID5A的终止密码子下游设计的sgRNA，其中：sgRNA1序列为：GTGGGTGGGGCTGCCATTAG；sgRNA2序列为：AAGCCTGAGTTGGTCTGCGT；sgRNA3序列为：GGTGGTGGATGTAGATTTCT；sgRNA4序列为：TTGAAATCACCGGAGGTGCC。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的上下游同源臂序列分别如下：上游同源臂序列为：CAGCTGTTCACCTCCCAGAGAGTCCCCAGAGCCCCAAAGGGCTGACTGAGAACTCCAGGCACCGGCTGACCCCTCAGGAGGGATTGCAGGCCCCAGGTGGCAGCCTCAGAGAGGAGGCGCAGGCAGGCCCCTGCCCGGCAGCCCCCATCTTCAAGGGCTGCTTCTACACCCACCCCACCGAGGTGCTGAAGCCTGTCAGCCAGCACCCCAGGGACTTCTTCTCTAGACTTAAAGATGGGGTGCTATTGGGGCCTCCTGGCAAAGAGGGGCTGTCAGTGAAAGAGCCCCAGCTGGTGTGGGGCGGAGACGCTAACCGCCCTTCTGCGTTCCATAAAGGTGGCTCCAGAAAGGGCATCCTCTACCCCAAGCCCAAAGCCTGCTGGGTGTCCCCCATGGCCAAGGTCCCAGCCGAGAGCCCCACGCTCCCGCCCACCTTCCCCAGTAGCCCAGGCCTGGGCAGCAAGCGCAGCCTGGAGGAAGAGGGTGCTGCCCACAGTGGGAAGAGACTGCGGGCCGTGTCTCCCTTTCTTAAGGAGGCGGATGCCAAGAAGTGTGGGGCCAAACCTGCAGGGTCCGGCCTGGTCTCCTGCCTTCTGGGCCCAGCCCTGGGGCCTGTGCCCCCAGAGGCCTACAGGGGCACCATGCTGCACTGCCCGCTGAACTTCACTGGCACCCCGGGCCCCTTGAAGGGCCAGGCTGCACTCCCCTTCAGCCCCCTGGTCATCCCGGCCTTCCCGGCCCACTTCCTGGCCACCGCAGGCCCCTCGCCCATGGCCGCTGGCCTGATGCACTTCCCCCCAACGTCCTTCGACAGTGCCCTCCGCCACAGACTTTGCCCGGCCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏海滨，黎维康，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61