一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新Trx‑β‑葡萄糖苷酶的基因，所述基因为序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示；或者是与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同生物学功能蛋白质的序列；或者是能与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的序列。本发明专利技术如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx的融合，得到大量可溶形式的Trx‑β‑Glucosidase融合蛋白，并通过简单的亲和层析的纯化方法得到高纯度高活性的重组Trx‑β‑葡萄糖苷酶，为大量产业化生产β‑葡萄糖苷酶提供基础。

Gene and protein expression, vector and application of a new Trx-beta-glucosidase

The present invention relates to a novel Trx beta glucosidase gene, which is shown by the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 in the sequence list, or has more than 90% homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1 and encodes the same biological functional protein sequence, or can hybridize with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1 and encode the same biological functional protein. Sequence. For example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 in the sequence table can utilize pET32 vector and E.coli expression strain to realize the fusion of the expressed product and solubilizing factor Trx, obtain a large number of soluble forms of Trx beta Glucosidase fusion protein, and obtain high purity and high activity recombinant Trx beta glucosidase by simple affinity chromatography purification method, which is a large amount of industrialization. The production of beta-glucosidase provides a basis.

【技术实现步骤摘要】
一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用
本专利技术属于生物分子克隆
，涉及一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因及其蛋白表达、载体和应用。
技术介绍
纤维素是一种由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键结合而成的葡聚糖大分子链，作为植物细胞壁的重要成分，是世界上最丰富、最廉价且未得到充分利用的可再生性资源。纤维素生物质如农林业废弃物和部分城市工业废物经酶解糖化生产乙醇等生物能和其他生物基制产品，对于解决粮食短缺、能源危机和环境污染等问题意义重大。纤维素资源的生物炼制需经过3个基本步骤：粉碎、预处理、酶水解，提高纤维素酶对纤维素原料的水解效率是降低成本提高经济效益的关键技术之一。纤维素酶是多组分的复合酶，包含3类主要成分：内切-β-葡聚糖酶(CMC酶)、外切-β-葡聚糖酶(C1酶、纤维二糖水解酶)、β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶、CB)。纤维素酶在将纤维素水解成葡萄糖的过程中，依靠不同组分之间的协同作用才能完成。结晶底物首先在C1组分作用下，成为对水解敏感区，然后被多组分酶Cx水解，最后由β-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。因此，β-葡萄糖苷酶在纤维素的分解过程中起着重要作用。其次，β-葡萄糖苷酶有转糖苷活力，目的即通过具有转苷活力的葡萄糖苷酶合成功能性低聚葡聚糖、低聚麦芽寡糖、低聚纤维寡糖等可以作为益生元的功能性糖类。此外，β-葡萄糖苷酶在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和印染行业等方面都具有重要应用价值。但是目前纤维素酶的生产成本高使得纤维素酶的应用受到限制。因此采用基因工程技术，深入研究纤维素酶的作用机制，加强对纤维素酶的分子生物学研究，特别是要注意利用DNA基因重组技术的应用，利用外源基因表达系统生产β-葡萄糖苷酶将为该酶的生产应用奠定坚实基础；选育出活性高、产酶量大的菌种，获得产量高，纯度好，有蛋白活性的单种类纤维素酶，进一步提高纤维素酶系组成中β-葡萄糖苷酶比例，成为研发热点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因，目的之二在于提供这种基因所编码的新Trx-β-葡萄糖苷酶蛋白，以及含有这种基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等表达载体，目的之四在于提供一种所述基因编码的新Trx-β-葡萄糖苷酶的制备方法及其纯化方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：1)序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列；2)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；3)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。进一步，与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；进一步，与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有96％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；进一步，与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有97％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；进一步，与SEQIDNO.1所示核苷酸序列杂交条件为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可以杂交条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。其中SEQIDNO.1所示核苷酸序列由1617个脱氧核苷酸组成，编码序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸残基序列的蛋白。1)序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列；2)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；3)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。以上三种任一种基因编码得到的Trx-β-葡萄糖苷酶属于本专利技术的保护范围。进一步，所述Trx-β-葡萄糖苷酶为如下(1)或(2)的蛋白：(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示；(2)序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由SEQIDNO.2衍生的蛋白质。序列表中的SEQIDNO.2由539个氨基酸残基组成，其编码基因的读码框包含1617个核苷酸。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。3.含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。进一步，所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。所述目的基因选自以下三种核苷酸序列中的一种：1)序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列；2)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；3)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。进一步，所述空载体为pET32载体。进一步，所述重组载体为将上述基因插入表达载体pET32的BamHI和HindIII酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。4.一种Trx-β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：a.将上述的基因重组到构建到pET32载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；b.将步骤a表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的Trx-β-葡萄糖苷酶。进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含50～100mM咪唑的pH8.0缓冲液预洗柱子，然后用含150mM～400mM咪唑的pH8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。进一步，还包括在pH值为6.0～6.5的条件下透析，将透析后的物质超滤浓缩。根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本专利技术的保护范围。5.上述技术方案1所述基因、技术方案2或4所述蛋白、技术方案3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和/或印染领域中的应用。进一步，所述蛋白在乳制品中的乳糖水解中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过改造和测试大量的核苷酸序列专利技术出如序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列可以利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新Trx‑β‑葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种新Trx-β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：1)序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列；2)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；3)与SEQIDNO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的基因编码得到的Trx-β-葡萄糖苷酶。3.根据权利要求2所述的Trx-β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所述Trx-β-葡萄糖苷酶为如下(1)或(2)的蛋白：(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示；(2)序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由SEQIDNO.2衍生的蛋白质。4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.根据权利要求4所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪波，米丹，张赛名，胡兴，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43