The present application belongs to the technical field of tobacco metabolites, and specifically relates to a patent application for improving the activity of putrescine N methyltransferase (PMT) in tobacco leaf extracts. The method is aimed at extracting putrescine N methyltransferase from fresh tobacco leaves, including preparation of extract (RIPA, NEB or PBS), pretreatment of tobacco leaves and extraction by solution method. The preliminary results showed that the activity of putrescine N methyltransferase (PMT) in the extract was improved to 9.6 x 10 by optimizing the extraction parameters.
【技术实现步骤摘要】
一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶的提取方法
本申请属于烟草代谢物
,具体涉及一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活提取方法专利申请事宜。
技术介绍
烟草作为一种较为特殊的经济作物,其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能,创制新的育种材料,对烟草代谢物进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。烟草中的香气物质是烟草内形成的一类次生代谢产物,目前按照致香功能团可分为酸类、醇类、酮类、醛类、酯类、酚类等,其中对烟草香气贡献最大的3类物质分别为多酚类化合物、萜类化合物以及生物碱。普通烟草栽培品种中主要有烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱4种生物碱,其中烟碱的含量最高,这些生物碱分别由不同代谢途径生成,腐胺N-甲基转移酶(PMT)被认为是烟碱合成的限速酶,催化二胺腐胺甲基化生成N-甲基腐胺。由于此生物酶的重要作用,对于该酶的深入研究,对于烟草生理生化的深入研究、以及烟草新材料鉴定、新品种培育都具有十分重要的意义。现有技术中,植物蛋白(包括生物酶)的提取方法主要有两种:溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂,会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性,因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时,由于不同蛋白(生物酶)特性不同,因此具体提取所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性,往往均需重新设计。而现有技术中尚未见到较好的提取腐胺N-甲基转移酶(PMT)提取方法报道。
技术实现思路
本申请目的在于提供一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶(PMT)酶活提取方法,从而为烟草生长代谢研究奠定一定 ...
【技术保护点】
1.一种提高烟叶提取物中腐胺N‑甲基转移酶酶活的提取方法,其特征在于,该方法针对新鲜烟叶中腐胺N‑甲基转移酶的提取,具体包括如下步骤:(1)制备提取液,具体采用裂解液RIPA 、NEB或PBS;配方组成为:裂解液RIPA:pH 8.0的Tris‑Cl、50 mM,EDTA、1mM,SDS、0.1%,NaCl、150 mM,NP‑40、1%,PMSF、1 mM;缓冲液NEB: pH 7.5的Hepes、20mM,KCl、40 mM,EDTA、1 mM,PMSF、1 mM;(2)烟叶预处理将烟草8‑12叶期的新鲜烟叶,研磨成粉备用;(3)溶液法提取在步骤(2)研磨成粉烟叶样品中加入步骤(1)中制备的提取液,震荡混匀后,冰上静置不少于1h;具体用量方面,研磨成粉烟叶样品100mg,提取液用量为500μl‑1mL;静置完成后,5000~15000rpm离心不少于20min,保留上清液,即为含有较高腐胺N‑甲基转移酶酶活的提取液。
【技术特征摘要】
1.一种提高烟叶提取物中腐胺N-甲基转移酶酶活的提取方法,其特征在于,该方法针对新鲜烟叶中腐胺N-甲基转移酶的提取,具体包括如下步骤:(1)制备提取液,具体采用裂解液RIPA、NEB或PBS;配方组成为:裂解液RIPA:pH8.0的Tris-Cl、50mM,EDTA、1mM,SDS、0.1%,NaCl、150mM,NP-40、1%,PMSF、1mM;缓冲液NEB:pH7.5的Hepes、20mM,KCl、40mM,EDTA、1mM,PMSF、1mM;(2)烟叶预处理将烟草8-12叶期的新鲜烟叶,研磨成粉备用;(3)溶液法提取在步骤(2)研磨成粉烟叶样品中加入步骤(1)中制备的提取液,震荡混匀后,冰上静置不少于1h;具体用量方面,研磨成粉烟叶样品100mg,提取液用量为500μl-1mL;静置完成后,5000~15000rpm离心不少于20min,保留上清液,即为含有较高腐胺N-甲基转移酶酶活的提取液。2.如权利要求1所述提高烟叶...
【专利技术属性】
技术研发人员:翟妞,周会娜,张慧,徐国云,陈千思,刘萍萍,郑庆霞,许亚龙,王晨,李晶,卢鹏,
申请(专利权)人:中国烟草总公司郑州烟草研究院,
类型:发明
国别省市:河南,41
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