角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法技术

本发明专利技术涉及一种角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法。其特征是经庆大霉素溶液处理后的角膜缘组织剪切小块后置于组织消化液中消化、过滤、收集组织细胞沉淀，之后用角膜缘干细胞原代培养液重悬上述沉淀，接种于用角膜缘干细胞包被液预处理的细胞培养板进行原代培养，待出现细胞克隆球后，使用组织消化液对细胞克隆球进行消化，然后离心、收集细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，后接种在上述预处理的细胞培养板中进行继代培养，即获得稳定的角膜缘干细胞。为获得更多稳定的角膜缘干细胞，在上述的继代培养之后还可进行多代扩增培养，获得稳定性好、安全性高、以满足临床上应用的大量干细胞。

In vitro culture of corneal limbal stem cells

The invention relates to an in vitro culture method for corneal limbal stem cell stability. It is characterized by cutting small pieces of corneal limbal tissue after gentamicin solution treatment, digesting, filtering and collecting tissue cell precipitation in tissue digestion solution, then suspending the above precipitation with the primary culture medium of corneal limbal stem cells, inoculating them into the cell culture plate pretreated with the coating liquid of corneal limbal stem cells for primary culture, and using tissue digestion solution after the appearance of cell clone ball. Cell clone ball was digested, centrifuged, collected and precipitated, then suspended with limbal stem cell subculture medium, and then inoculated in the cell culture plate pretreated above for subculture, that is to say, stable limbal stem cells were obtained. In order to obtain more stable limbal stem cells, the above subcultures can be expanded and cultured for generations to obtain a large number of stem cells with good stability and safety to meet the clinical application.

【技术实现步骤摘要】
角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法
本专利技术属于干细胞培养
，具体涉及一种角膜缘干细胞稳定性（即在角膜缘干细胞增殖过程中不发生分化、能够维持其干细胞属性）的体外培养方法。
技术介绍
角膜缘干细胞位于角膜缘基底层独特的波浪形结构“Vogt栅栏”中，是角膜上皮细胞更新的来源。角膜缘干细胞更新能够保持角膜缘上皮细胞连续性的水平向心及垂直向上运动，从而保证角膜上皮层结构的完整和功能的正常。在这个过程中，一方面，角膜缘干细胞通过对称分裂进行自我更新，即细胞增殖且保持其干细胞属性的方式保证干细胞巢中的干细胞数量处于稳定；另一方面，通过不对称分裂，即增殖和分化的方式，细胞迁移至需要更新的角膜上皮细胞的位置，替代原来的角膜上皮细胞。研究已表明，角膜缘干细胞的增殖压力还能够抑制结膜上皮细胞的长入，并防止角膜缘部的结膜血管入侵。当各种损伤因素导致角膜缘干细胞的缺失或影响其生存微环境而使其自我更新和分化功能严重受损时，引起角膜上皮结构不能重建，结膜上皮及血管翳移行修复角膜表面，导致角膜混浊、视功能下降。因此，通过体外培养获得能够增殖且保持干性的角膜缘干细胞，用于角膜缘缺损/病变的治疗，是临床移植治疗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法，其特征在于首先将清洗干净的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中消毒处理，然后将漂洗后的角膜缘组织置于组织消化液中剪切成小块后进行消化，而后过滤、离心、收集角膜缘组织细胞沉淀，再用角膜缘干细胞原代培养液重悬上述组织细胞沉淀，并接种于用角膜缘干细胞包被液预处理的细胞培养板进行原代培养，待出现细胞克隆球后，再使用上述组织消化液对细胞克隆球进行消化，然后离心、收集角膜缘干细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板进行继代培养，即可获得稳定的角膜缘干细胞；上述庆大霉素溶液是含有104 U/100ml庆大霉素的...

【技术特征摘要】
1.一种角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法，其特征在于首先将清洗干净的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中消毒处理，然后将漂洗后的角膜缘组织置于组织消化液中剪切成小块后进行消化，而后过滤、离心、收集角膜缘组织细胞沉淀，再用角膜缘干细胞原代培养液重悬上述组织细胞沉淀，并接种于用角膜缘干细胞包被液预处理的细胞培养板进行原代培养，待出现细胞克隆球后，再使用上述组织消化液对细胞克隆球进行消化，然后离心、收集角膜缘干细胞沉淀，再用角膜缘干细胞继代培养液重悬细胞，获得游离的角膜缘干细胞，然后接种在上述预处理的细胞培养板进行继代培养，即可获得稳定的角膜缘干细胞；上述庆大霉素溶液是含有104U/100ml庆大霉素的DMEM/F12培养基；上述组织消化液是2.4~4.8U/ml的DispaseII酶溶解于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞原代培养液的配方是含有5~10%胎牛血清、10~40ng/ml表皮生长因子、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10μg/ml胰岛素、1~10μg/ml转铁蛋白、1~5ng/ml亚硒酸钠、0.2~1μg/ml氢化可的松、5~20ng/ml白血病抑制因子、5~10ng/ml白介素-6和5~10%角膜缘成纤维细胞培养上清液的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞继代培养液的配方是含有5~10%胎牛血清、10~40ng/ml表皮生长因子、10~20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1~10μg/ml胰岛素、1~10μg/ml转铁蛋白、1~5ng/ml亚硒酸钠、0.2~1μg/ml氢化可的松、5~20ng/ml白血病抑制因子和5~10ng/ml白介素-6的DMEM/F12培养基；上述角膜缘干细胞包被液的配方是含有10~30μg/ml纤连蛋白、5~20μg/ml层粘连蛋白5、1~2mg/ml明胶、1~5mg/ml透明质酸和1~5mg/ml肝素的DMEM/F12培养基。2.权利要求1所述的角膜缘干细胞稳定性的体外培养方法，其特征是上述继代培养获得的角膜缘干细胞的多代扩增培养方法：角膜缘干细胞长满后再利用常规方法对...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐彬，樊廷俊，郑明月，田成磊，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37