本发明专利技术公开了一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，yau403与CRd基因紧密连锁，可用于芸薹种包括结球白菜和青梗菜抗根肿病基因的分子标记辅助选择。在辅助选择过程中同时使用这些标记，选择理论准确度可达到100％，并且该标记重复性好，可靠性高，检测成本低，省时省力。
Close-Linked Molecular Marker Yau403, Primers and Application of CRd Gene for Resistance to Root Swollen Disease in Chinese Cabbage
The present invention discloses a closely linked molecular marker yau403 of the CRd gene of Chinese cabbage, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1, and yau403 is closely linked to CRd gene, which can be used for marker-assisted selection of Brassica species including heading Chinese cabbage and Chinese cabbage. When these markers are used in the process of assistant selection, the accuracy of selection theory can reach 100%, and the marker has good repeatability, high reliability, low detection cost, time-saving and labor-saving.
【技术实现步骤摘要】
大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403、引物及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403、引物及应用。
技术介绍
本课题组对大白菜自交系‘85-74’进行了抗病性鉴定，研究表明该抗病材料抗芸薹根肿菌生理小种4，进一步研究证明抗根肿病基因为显性单基因，并命名为CRd。(Pang等，IdentificationandmappingoftheclubrootresistancegeneCRdinChinesecabbage(Brassicarapassp.pekinensis)，Front.PlantSci.9:653.)。在芸薹种抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法鉴定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，这样势必影响转育进程，因此抗病品种转育难的问题还没有彻底解决。分子标记辅助选择技术(MAS)可能是最终解决这一问题的有效途径。目前，国内沈阳农业大学朴钟云课题组获得了与芸薹种抗根肿病基因CRb连锁的标记(2004,2014)，包括TCR01，TCR05和TCR09，见(Piao等，SCARandCAPSmappingofCRb,ageneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage(Brassicarapassp.pekinensis)，以及TCR108、TCR30、TCR74、TCR79，见(Zhang等，FinegeneticandphysicalmappingoftheCRbgeneconferringresistancetoclubrootdiseaseinBrassicarapa.，MolBreeding，34:1173-1183)。但这些标记都是与CRb基因有关的标记，目前为止，并未发现与CRd基因有关的标记。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403、引物及应用，利用该分子标记可对待测植株进行苗期鉴定，从而减少连锁累赘，简化大白菜抗根肿病品种的转育程序。本专利技术提供了一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403，所述大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，为：5’-TGTCACCAGCGCATTATAGCATTGCTCCCCTCATTAAAAAGCACAGCCACAAAGCTTCCATTTTTATTCTTACAAAATTATTATCATTCAGACCAAACTGAAAAAAGGAAGAGAGAGAAGGGGATTCATCATCAACCCATCTTCCCTCCCTT-3’。本专利技术还提供了一种上述大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403的PCR特异性扩增引物，包括：Fyau403:5’-TGTCACCAGCGCATTATAGC-3’Ryau403:5’-CAACCCATCTTCCCTCCCTT-3’。本专利技术还提供了一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403在分子标记辅助选择中的应用。本专利技术还提供了一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403在大白菜抗根肿病分子标记辅助选择中的应用。本专利技术还提供了一种上述大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403的应用方法，具体包括：(1)提取待测材料的基因组DNA(2)PCR扩增a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA；5pmol·L-1引物；1.0mmol·L-1dNTP；1.0uL10×PCRBuffer；0.5UTaqDNA聚合酶；ddH2O补齐10μL，混匀，离心；其中引物的序列为Fyau403:5’-TGTCACCAGCGCATTATAGC-3’，Ryau403:5’-CAACCCATCTTCCCTCCCTT-3’；b.扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火45s；72℃延伸30s；35个循环后；72℃延伸5min；最后4℃保存；c.电泳：将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，95℃变性6min，之后在DNA测序电泳仪上进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银染，并观察扩增结果；d.判断：扩增结果中如果能够检测到152bp条带，则待测材料中含有大白菜抗根肿病基因CRd的概率为100％。本专利技术提供的一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403，可广泛应用于芸薹种抗根肿病基因CRd的分子标记辅助选择育种。本专利技术通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短育种进程。附图说明图1为yau403在抗病材料‘85-74’、感病材料‘BJN3-1’以及感病个体、抗病个体中的扩增结果；图2为yau403的引物在大白菜抗病材料和感病材料当中扩增出来的序列对比图；图3为大白菜抗根肿病CRd基因的遗传连锁图谱。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。一、大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403的获得1、分离群体的构建以含抗根肿病基因CRd的大白菜品系’85-74’为父本，易感染根肿病的大白菜品系‘BJN3-1’为母本杂交获得F1，所获F1代植株全部表现为抗病。以上两个亲本’85-74’和‘BJN3-1’均保存于沈阳农业大学。选择单株F1自交构建F2代作图群体，群体数为432个。播种的全部432个F2群体，种植10天后接种根肿菌。40天后进行抗病性鉴定，432个F2群体中321个抗病，106个感病，经卡方检验符合3:1的分离比2、CTAB法提取DNA1)、在1.5ml离心管中加入498uL1×CTAB提取液以及2uLβ-巯基乙醇，摇匀，其中1×CTAB提取液包含2％的CTAB，100mmol/L的Tris-HCl，20mmol/L的EDTA和1.4mol/L的NaCl，其中2％的CTAB指的质量浓度为2％(w/v)；2)、取0.2g幼嫩叶片，在液氮条件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-巯基乙醇的离心管中，摇匀；3)、随后将离心管放入65℃水浴中，每隔5分钟摇一次，水浴30min；4)、取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇混合物(24:1，v/v)，摇晃10min后，常温下12000r/min离心10min；5)、将上清液转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v),摇晃10min后，常温下12000r/min离心10min；6)、将上清液移至另一离心管当中，加入2倍体积事先预冷的无水乙醇，混匀后，将抱团的DNA挑入到装有400uLTE缓冲液的离心管中溶解；7)、加入1.5uLRNaseA(10ug/uL)，混匀后37℃保存30min；8)、重复步骤5)；9)、将上清液转移到另一离心管中，向离心管中加入50uL3mol/LNaAC溶液和预冷的等体积的异丙醇，-20℃沉淀20min；10)、4℃条件下12000r/m离心10min，弃掉上清液，加入75％的乙醇清洗2次；11)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403，其特征在于，所述大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：5’‑TGTCACCAGCGCATTATAGCATTGCTCCCCTCATTAAAAAGCACAGCCACAAAGCTTCCATTTTTATTCTTACAAAATTATTATCATTCAGACCAAACTGAAAAAAGGAAGAGAGAGAAGGGGATTCATCATCAACCCATCTTCCCTCCCTT‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403，其特征在于，所述大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，为：5’-TGTCACCAGCGCATTATAGCATTGCTCCCCTCATTAAAAAGCACAGCCACAAAGCTTCCATTTTTATTCTTACAAAATTATTATCATTCAGACCAAACTGAAAAAAGGAAGAGAGAGAAGGGGATTCATCATCAACCCATCTTCCCTCCCTT-3’。2.一种权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403的PCR特异性扩增引物，其特征在于，包括：Fyau403:5’-TGTCACCAGCGCATTATAGC-3’Ryau403:5’-CAACCCATCTTCCCTCCCTT-3’。3.根据权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403在分子标记辅助选择中的应用。4.根据权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403在大白菜抗根肿病分子标记辅助选择中的应用...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴钟云，付鹏宇，庞文星，李晓楠，战宗祥，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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