本发明专利技术公开了一种牛SERPINA3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用，以待测黄牛全基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛SERPINA3基因部分片段，通过PCR‑RFLP技术进行基因遗传变异检测，本发明专利技术的检测方法简单、快速、成本低，检测结果准确、可靠，适用于对黄牛SERPINA3基因遗传变异位点的大规模的基因分型，为黄牛生长和胴体性状的分子标记辅助选择提供了新的遗传标记，从而可以加快建立遗传资源优良的黄牛种群。
Method and Application of Bovine SERPINA3 Gene Genetic Marker Assisted Detection of Bovine Growth and Carcass Traits
The invention discloses a method for assisting detection of growth and carcass traits of cattle by genetic markers of bovine SERPINA3 gene and its application. The whole genome DNA of cattle to be tested is used as a template, part of the SERPINA3 gene fragment of cattle is amplified by PCR, and genetic variation of cattle is detected by PCR RFLP technology. The detection method of the invention is simple, fast, low cost, accurate and reliable, and is applicable to cattle. The large-scale genotyping of SERPINA3 genetic variation loci in cattle provides a new genetic marker for marker-assisted selection of growth and carcass traits of cattle, thus speeding up the establishment of cattle populations with excellent genetic resources.
【技术实现步骤摘要】
牛SERPINA3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学技术和牛育种领域，涉及基因突变位点的检测，具体涉及一种牛SERPINA3基因SNP标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及试剂盒。
技术介绍
我国地方黄牛品种资源丰富，但相对国外优质牛品种，呈现出体格偏小、后驱不发达、生长速度慢、屠宰率和净肉率偏低等问题，这在现代肉牛生产规模化养殖发展过程中不占有优势。因此，对我国地方优良牛品种的选育势在必行，培育出生长速度快、净肉率高的优质地方牛品种，对促进畜牧业的发展具有重要的意义。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是由单个碱基的置换引起的位点多态性，是生物体基因组中最为广泛的一类变异，SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。SNP标记因其遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛、检测快速方便等特点，已被广泛应用。基于限制性片段长度多态性技术(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)的PCR-RFLP法在SNP的检测中被大量使用。应用此方法的前提是SNP的位点必须含有合适的限制性内切酶识别位点。利用限制性内切酶对目的片段进行切割，然后进行凝胶电泳分析，就能准确的鉴别SNP位点的基因型。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpinpeptidaseinhibitor,cladeA,member3,SERPINA3)，又称α1-抗胰凝乳蛋白酶(α1-antichymotrypsin)，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族A亚型，由423个氨基酸组成，其抑制胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G等几种丝氨酸蛋白酶的活性(KalshekerNA,1996)。SERPINA3参与如凝血、增强活化、细胞凋亡、伤口愈合、胚胎发育、肌肉细胞和肌肉纤维细胞的分化和增殖等生理活动(Péré-Brissaudetal.2015；ZhouJetal.2016)。SERPINA3的过表达会降低细胞间的黏附，抑制细胞凋亡(Chelbietal.2012)导致恶性肿瘤的发生。在畜禽生产中，肌肉的产量是决定畜禽经济价值的最重要因素之一，有研究表明，SERPINA3在牛骨骼肌分化中起非常重要的作用，PatrickPelissier等(2008)将牛SERPINA3基因定位于21q24区域的辐射杂交图中且仅横跨2.35×105个碱基，不同的牛SERPINA3具有不同的组织特异性模式和不同的糖基化和磷酸化状态。Péré-Brissaud等(2015)研究发现在夏洛莱肉牛中，SERPINA3影响牛骨骼肌细胞的分化和增殖。目前尚未见到关于中国地方黄牛品种中SERPINA3基因与生长及胴体性状优势相关联的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛SERPINA3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用，通过对与生长和胴体性状关联的单核苷酸多态性位点的检测，利用确定的遗传标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种检测牛SERPINA3基因突变位点多态性的方法，包括以下步骤：以待测黄牛(例如，秦川牛)全基因组DNA为模板，以引物对S为引物，PCR扩增黄牛SERPINA3基因部分片段，用限制性内切酶HhaI酶切PCR扩增产物，再对酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛SERPINA3基因上单核苷酸多态性位点(SERPINA3基因外显子1第357位SNP，参考序列为AC_000178.1)的基因型。优选的，所述引物对S为：上游引物S-F：5’-TTCAGCCTCTACAAGCA-3’；下游引物S-R：5’-TTCACCAGGACCAACA-3’。优选的，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸10min；16℃保存。优选的，所述琼脂糖凝胶电泳所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。优选的，所述黄牛SERPINA3基因上单核苷酸多态性位点有GG、GA和AA三种基因型，酶切后的产物的琼脂糖凝胶电泳结果为：GG基因型(野生纯合型)表现为252bp和203bp两条电泳条带，GA基因型(杂合型)表现为455bp、252bp和203bp三条电泳条带，AA基因型(突变纯合型)表现为455bp一条电泳条带。一种检测牛SERPINA3基因突变位点多态性的试剂盒，包括上述用于进行黄牛SERPINA3基因外显子1第357位SNP位点分型的PCR扩增引物对S，以及PCR-RFLP检测所需其他试剂。本专利技术具有以下有益技术效果：本专利技术根据筛查得到的目的基因SERPINA3上的单核苷酸突变，使用PCR-RFLP技术进行遗传突变分型，最终从DNA水平上鉴别SERPINA3基因上单核苷酸多态性(SNP)位点(SERPINA3基因外显子1第357位SNP，参考序列为AC_000178.1)的基因型，具有简便、快速、准确、灵敏的优点。根据所检测的SERPINA3基因SNP与黄牛生长和胴体性状的关联分析，SERPINA3基因在该SNP位点的不同基因型对黄牛的生长和胴体性状有显著或极显著影响(P<0.05或P<0.01)，即SERPINA3基因上的该SNP位点的基因型可以作为黄牛生长和胴体性状有效的选择标记，使得检测方法可以用于中国黄牛(例如，秦川牛)优质肉用生长和胴体性状的标记辅助选择，从而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。附图说明图1是不同样本(泳道1～10)SERPINA3基因PCR扩增电泳图。图2是SERPINA3基因PCR扩增产物经酶切后的分型(GA、GG、AA)电泳图。图3是SERPINA3基因不同基因型对应的测序图谱：自上而下分别是GA、GG和AA基因型测序图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做详细说明，所述实施例是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术根据NCBI数据库中已公布的牛SERPINA3基因的序列设计引物，以牛基因组DNA为模板，进行PCR扩增，随机等量混合个体的PCR产物为1个样品并对其进行测序。根据样品测序结果和NCBI数据库中已公布的序列，使用BLAST软件比对，筛查出SNP位点。之后，对待测牛群体进行多态位点(SNP)的PCR-RFLP检测。最后，根据检测到的位点不同基因型，进行群体遗传统计分析和生长和胴体性状的关联分析，筛选出与牛生长和胴体性状密切相关的遗传标记。I、牛SERPINA3基因部分DNA序列的多态性检测本专利技术根据数据库中已公布牛SERPINA3基因(NCBIReferenceSequence:AC_000178.1)的序列设计引物，以秦川牛的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的牛SERPINA3基因的DNA序列与NCBI公布的DNA序列进行比对，发现在秦川牛SERPINA3基因外显子1第357位存在单核苷酸突变，鉴定为SNP位点。1、牛全血样本采集本专利技术具体以中国地方黄牛品种中的秦川牛作为检测对象，具体样本采集见表1：表1.牛全血样本的采集2、基因组DNA的提取血液基因组DNA提取过程具体步骤如下：(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测牛SERPINA3基因突变位点多态性的方法，其特征在于：以待测黄牛基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛SERPINA3基因部分片段，对PCR扩增得到的片段经限制性内切酶Hha I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛SERPINA3基因上第一外显子第357位SNP位点的基因型。
【技术特征摘要】
1.一种检测牛SERPINA3基因突变位点多态性的方法，其特征在于：以待测黄牛基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛SERPINA3基因部分片段，对PCR扩增得到的片段经限制性内切酶HhaI酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛SERPINA3基因上第一外显子第357位SNP位点的基因型。2.根据权利要求1所述一种检测牛SERPINA3基因突变位点多态性的方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的引物对为：上游引物S-F：5’-TTCAGCCTCTACAAGCA-3’；下游引物S-R：5’-TTCACCAGGACCAACA-3’。3.根据权利要求1所述一种检测牛SERPINA3基因突变位点多态性的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸10min。4.根据权利要求1所述一种检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺花，胡志刚，刘小林，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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