本发明专利技术提供了检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的引物及方法，引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，本发明专利技术建立了莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同CO2浓度培育的空心莲子草后AK基因表达量检测的荧光定量PCR法，并进行了转录组的测序，对AK基因荧光定量的表达量趋势与转录组的表达量趋势做了比较，为研究莲草直胸跳甲受到环境胁迫时产生的防御机制及AK基因表达特性奠定了基础。
Primers and Methods for Detecting AK Gene Expression in Lotus Straight-breasted Juglans
The invention provides primers and methods for detecting the expression characteristics of AK gene in Lotus straightbreast beetle. The primer sequence is shown in SEQ ID NO.1 2. The invention establishes a fluorescence quantitative PCR method for detecting the expression level of AK gene after the female and male of Lotus straightbreast beetle feeding on different CO2 concentration cultured Lotus straightbreast beetle, and carries out transcription sequencing, and the fluorescence quantitative expression trend and transcription of AK gene. The expression trend of group A was compared, which laid a foundation for studying the defense mechanism and AK gene expression characteristics of Lotus straightbreast jumper under environmental stress.
【技术实现步骤摘要】
检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的引物及方法
本专利技术涉及检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的引物及方法，属于生物
技术介绍
莲草直胸跳甲属鞘翅目，叶甲科，是空心莲子草的主要生防天敌之一。GeorgeVogt于1962年首次发现了莲草直胸跳甲对空心莲子草有很好的控制作用。其后，莲草直胸跳甲在美国、澳大利亚等地被广泛应用于空心莲子草的控制，并取得了较好的防治效果。我国于1986年从美国引进莲草直胸跳甲，并应用于空心莲子草的生物防治，在四川、浙江、福建、广西等地取得一定的成功。在昆虫生命活动过程中，精氨酸激酶(Argininekinase,AK)是其体内主要的磷酸原激酶，它通过催化精氨酸和ATP之间的可逆性反应，将能量存储于磷酸精氨酸的高能磷酸键中，或将磷酸精氨酸分解产生ATP，是一个与ATP再生、肌肉收缩和细胞内能量运转等直接相关的重要激酶。由于精氨酸激酶仅存在于无脊椎动物中，并且该酶及其磷酸原的能量代谢途径与哺乳动物中的完全不同，因此精氨酸激酶可以作为控制昆虫的一个很好的敏感靶标。1998年从意大利蜜蜂克隆得到首个昆虫精氨酸激酶cDNA序列以来，目前已经有9个目、几十种昆虫的精氨酸激酶基因cDNA序列被鉴定出来，包括埃及伊蚊、美洲大蠊、家蚕、大红芫菁、东亚飞蝗等，这些基因推导表达的氨基酸序列的一致性都在50％以上。Alonso等(2001)对锥体虫精氨酸激酶的研究表明：在锥体虫对数增长期，精氨酸激酶的比活力基本维持恒定，而且mRNA的变化也很小，说明精氨酸激酶活力主要受蛋白质翻译后调节；同时在饥饿状态下，寄生虫指数增长阶段，AK的活性持续增加，推测AK可能作为一个能力转换的调节控件。用RNAi技术将黄曲条跳甲体内AK基因敲除，可以破坏其能量代谢途径，导致黄曲条跳甲生育力下降和死亡。精氨酸激酶的活性表达会受到多种因素的影响。Pereira等(2003)发现在锥体虫中使AK过量表达明显提高了锥体虫抵抗营养和pH逆境的能力，而且使其细胞生命活力提高。在甲壳动物中，精氨酸激酶是受到免疫刺激和病毒感染后变化最为明显的蛋白之一，说明与能量代谢有关的酶直接或间接参与相关的免疫反应。对烟夜蛾精氨酸激酶基因HassAK的研究表明，不仅高温条件能够诱导AK的表达，而且低温同样能促进其表达，推测HassAK基因可能也是一种抗逆相关基因。关于莲草直胸跳甲AK基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量PCR研究不同CO2浓度处理下莲草直胸跳甲AK基因的表达特性，结果表明，随着CO2浓度的升高，雌雄虫AK基因的表达量均升高，这与转录组表达量上调的变化趋势一致，说明CO2浓度升高可以影响AK基因的表达调控。精氨酸激酶仅存在于无脊椎动物体内，且磷酸精氨酸是昆虫肌肉中唯一有效形成ATP的磷酰基供体，这说明昆虫的能量代谢途径与脊椎动物完全不同，若将精氨酸激酶作为害虫控制的一个靶标，不仅可以开辟害虫分子调控的新领域，而且对高等动物也比较安全，可以为农业害虫的防治提供新的方法和思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的引物及方法，为全面了解莲草直胸跳甲AK基因的表达特性而设计的不同处理CO2浓度。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：将取食不同CO2浓度培育的空心莲子草的莲草直胸跳甲雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。设计一对检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的引物，包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：AK-F：5`-GGCTTGGATTCCTCACTTTCTG-3`AK-R：5`-ATACCACCCTCGGCTTCTG-3`以及作为内参基因的上下游引物：Tubulin-F:5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`Tubulin-R:5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`本专利技术所述检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的荧光定量PCR法，按如下步骤进行：（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；（2）对下述引物进行常规PCR检测该基因的荧光定量上下游引物：AK-F：5`-GGCTTGGATTCCTCACTTTCTG-3`AK-R：5`-ATACCACCCTCGGCTTCTG-3`以及作为内参基因的上下游引物：Tubulin-F:5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`Tubulin-R:5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`常规PCR扩增体系为25µL：10×buffer2.5µL，dNTP1.0µL，上游引物0.5µL，下游引物0.5µL，100ng/µLcDNA模板1.0µL，Ex-TaqE0.15µL，水19.35µL；常规PCR反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；（3）实时荧光定量PCR反应：以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。实时荧光定量PCR扩增体系为：SYBR®PremixExTaqTM12.5µL，上游引物0.5µL，下游引物0.5µL，100ng/µLcDNA1.0µL，补足水至25µL；实时荧光定量PCR反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。本专利技术更加详细的试验方法如下：莲草直胸跳甲AK基因的实时荧光定量PCR检测方法可通过以下步骤实现：（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲AK基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：AK-F：5`-GGCTTGGATTCCTCACTTTCTG-3`AK-R：5`-ATACCACCCTCGGCTTCTG-3`同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：Tubulin-F:5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`Tubulin-R:5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照CO2浓度（420μL·L－1）和高CO2浓度（750μL·L－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同CO2浓度的雌雄虫各采9只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。（3）cDNA第一链合成：参照全式金公司的TransZolTMUpPlusRNAKit试剂盒说明书提取总RNA，按照TransScript公司的One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒说明书，合成cDNA第一链。（4）实时荧光定量PCR反应：实时荧光定量PCR采用Takara公司的SYBR®PremixExTaqTM试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述AK-F、AK-R和Tubulin-F、Tubulin-R为特异性引物，进行荧光定量PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：AK‑F：5`‑GGCTTGGATTCCTCACTTTCTG‑3`，AK‑R：5`‑ATACCACCCTCGGCTTCTG‑3`。
【技术特征摘要】
1.一种检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：AK-F：5`-GGCTTGGATTCCTCACTTTCTG-3`，AK-R：5`-ATACCACCCTCGGCTTCTG-3`。2.一种采用权利要求1所述引物检测莲草直胸跳甲AK基因表达特性的荧光定量PCR方法，其特征在于：按如下步骤：（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；（2）以下述引物进行常规PCR检测该基因的荧光定量上下游引物：AK-F：5`-GGCTTGGATTCCTCACTTTCTG-3`AK-R：5`-ATACCACCCTCGGCTTCTG-3`以及作为内参基因的上下游引物：Tubulin-F:5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`Tubulin-R:5`-GCCTCTTGGTATTG...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑丽祯，傅建炜，何肖云，史梦竹，李建宇，林凌鸿，王秋月，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35
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