一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用，其中真菌漆酶突变体PIE5，是以定向进化手段对灰盖鬼伞漆酶Lcc9进行改造，构建突变文库，结合三轮筛选方法，获得的漆酶突变体，以提高漆酶的应用能力。本发明专利技术真菌漆酶突变体PIE5最适催化pH为8.5(愈创木酚为底物)，而且在pH至9.5时仍能够发挥良好活性，因此真菌漆酶PIE5相比之下具有碱性环境的应用优势，扩宽了真菌漆酶的应用领域，可直接应用于纺织整染工艺代替石磨水洗，在废水靛蓝降解中也无需调整废水pH，有利于改进真菌漆酶的纺织整染工艺，降低运行成本，保护生态环境。

A fungal laccase mutant PIE5 and its expression strain and Application

The invention discloses a fungal laccase mutant PIE5 and its expression strain and application, in which the fungal laccase mutant PIE5 is a directional evolution method to modify the laccase Lcc9 of Umbrella grisescens, construct a mutant library, and combine three rounds of screening method to obtain laccase mutant, so as to improve the application ability of laccase. The optimum catalytic pH of the fungal laccase mutant PIE5 of the invention is 8.5 (guaiacol is the substrate), and it can still play a good activity when the pH is 9.5. Compared with the fungal laccase PIE5, the fungal laccase PIE5 has the application advantages of alkaline environment, widens the application field of fungal laccase, can be directly applied to textile finishing and dyeing process instead of stone mill washing, and does not need to adjust the wastewater pH in the degradation of indigo. It is conducive to improving the textile finishing and dyeing process of fungal laccase, reducing the operation cost and protecting the ecological environment.

【技术实现步骤摘要】
一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用
本专利技术涉及一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用。
技术介绍
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能够催化多种底物如酚类、芳胺类等氧化，当一些小分子物质作为介体存在时，漆酶能够进一步拓宽其氧化底物，并同时将O2还原成水。漆酶分布广泛，在植物、动物和微生物等当中均有分布。其中，微生物是漆酶的最主要来源物种。一般情况下，真菌漆酶具有较高的氧化还原电势(470-790mV)，以及较高的比活力(100-1,000U/mg)。相比较，细菌漆酶氧化还原电势较低(340-490mV)，比活力也低于真菌漆酶(0.1-10U/mg)。因此，真菌漆酶具有更广泛的应用价值。由于真菌漆酶具有宽泛的底物特异性，它们在纸浆漂白、生物修复、染料降解、药物合成及生物降解等多种领域均有应用，具有重要的经济价值。目前，真菌漆酶在纺织整染特别是靛蓝脱色中应用最为广泛。在牛仔布的整染过程中，真菌漆酶可用于浮石洗涤过程，也可以用于后期的靛蓝降解过程。由于真菌漆酶仅能在酸性条件下发挥最佳活性(pH值3-5)，而在中性或碱性条件下，真菌漆酶虽然比较稳定，但是几乎无活力。因此，在牛仔布的整染过程中，需要将洗涤的pH值控制在5左右，而在反应结束后，需要将废水的pH调整到中性，这一过程增加了洗涤的成本，同时提高了水中的盐离子的浓度，不利于后期处理和环境保护。通过蛋白质工程改造，获得能在中性或碱性条件下发挥良好活性的真菌漆酶蛋白，将有利于改进真菌漆酶的纺织整染工艺，降低运行成本，保护生态环境。
技术实现思路
本专利技术基于现有技术的缺陷，旨在提供一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用。本专利技术真菌漆酶突变体PIE5，是以定向进化手段对灰盖鬼伞漆酶Lcc9进行改造，构建突变文库，结合三轮筛选方法，获得的漆酶突变体，以提高漆酶的应用能力。本专利技术真菌漆酶突变体PIE5，其氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。本专利技术真菌漆酶突变体PIE5，其氨基酸序列为SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。表达本专利技术真菌漆酶突变体PIE5的菌株，含有耐受碱性pH的真菌漆酶蛋白的编码基因，分类命名为PichiapastorispPIC9K-PIE5，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2018年7月19日，保藏编号：CCTCCNO：M2018451。本专利技术真菌漆酶突变体PIE5的制备方法，包括如下步骤：步骤1：将菌株Pichiapastoris/pPIC9K-PIE5接种于种子液体培养基中进行发酵，在15-35℃、100-250rpm/min条件下培养至菌体OD600＝2～6；将菌体离心后，用发酵液体培养基重悬细胞至OD600＝0.5-2.0，每隔24h加入甲醇使其中甲醇浓度为0.3-2.0％；将诱导后的发酵液离心后获得上清液，即为真菌漆酶粗酶液；步骤2：将步骤1所得真菌漆酶粗酶液在4-10℃、0.1-0.5MPa条件下进行浓缩超滤，获得浓缩粗酶液；随后以pH值3.5-6.5，更优选为pH值6.5、浓度为20mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在4-10℃进行透析三次以更换蛋白保存缓冲液；再以DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换柱对真菌漆酶进行纯化，获得真菌漆酶PIE5蛋白，并以凝胶电泳检测蛋白纯度。所述种子液体培养基的溶剂为pH值3.5-6.5、0.1M的PBS缓冲液，溶质及其浓度如下：YeastExtract10g/L、Tryptone20g/L、YNB13.4g/L、甘油10g/L、生物素4×10-4g/L。所述发酵液体培养基的溶剂为pH值3.5-6.5、0.1M的PBS缓冲液，溶质及其浓度如下：YNB13.4g/L、甲醇5g/L、硫酸铜1.5×10-2g/L、生物素4×10-4g/L。本专利技术真菌漆酶突变体PIE5的用途，是在染料脱色过程中作为脱色氧化剂的应用。所述染料脱色优选为靛蓝脱色过程。本专利技术真菌漆酶突变体PIE5的应用，是在染料脱色过程中作为脱色氧化剂使用，具体包括如下步骤：在反应体系pH值4.5-9.0、温度20-80℃、漆酶PIE5浓度40-200U/L、介体浓度20-300μM的条件下，对靛蓝染料进行脱色处理，靛蓝的脱色率达到83％以上。所述介体为丁香醛(DHB)、丁香酸(SA)、丁香酸甲酯(MS)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)或1-羟基苯并三唑(HBT)。当以丁香酸甲酯MS为介体时，将PIE5用于靛蓝脱色，优化后最适反应体系为：靛蓝浓度200μM、PIE5酶量160U/L、介体MS浓度120μM、体系pH为7.5下在60℃中反应50min，靛蓝脱色率达到83.1±1.1％(图2)。当以ABTS为介体时，将PIE5用于靛蓝脱色，优化后最适反应体系为：靛蓝浓度200μM、PIE5酶量180U/L、介体ABTS浓度200μM、体系pH为7.0下在60℃中反应180min，靛蓝脱色率达到90.9±0.3％(图3)。本专利技术对不同类型真菌漆酶对靛蓝的脱色能力，同时对比市售漆酶，优选为诺维信漆酶制剂对靛蓝的脱色能力比较。本专利技术以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为漆酶底物，每隔24h检测发酵过程中漆酶活力变化。酶活检测体系在30℃下反应3min后立即冰浴30S，在420nm处检测吸光值并计算酶活，定义一个单位的酶活(U)为一分钟内转化1μM底物所需的酶量。本专利技术中真菌漆酶活力均是以ABTS为底物所测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：真菌漆酶具有更为广泛的应用价值，但其催化pH一般在酸性3-5，所以在碱性环境下限制了真菌漆酶的应用。本专利技术获得一个真菌漆酶突变体PIE5，最适催化pH为8.5(愈创木酚为底物)，而且在pH至9.5时仍能够发挥良好活性，因此真菌漆酶PIE5相比之下具有碱性环境的应用优势，扩宽了真菌漆酶的应用领域，比如本专利技术将真菌漆酶PIE5用于纺织整染工艺中的靛蓝染料脱色中以取代传统工艺。纺织整染是真菌漆酶应用较为广泛的方向之一，传统在纺织整染中使用石磨水洗进行牛仔布仿旧处理，以及在染料废水处理时用传统使用物理吸附等手段。但这些方式不够绿色环保，真菌漆酶是一种绿色催化剂，能够氧化降解靛蓝，但纺织整染工艺的碱性环境限制了大部分真菌漆酶的应用，本专利技术所获得碱性真菌漆酶PIE5可用于纺织整染工艺尤其是靛蓝脱色中。碱性突变体PIE5可直接应用于纺织整染工艺代替石磨水洗，在废水靛蓝降解中也无需调整废水pH，将有利于改进真菌漆酶的纺织整染工艺，降低运行成本，保护生态环境。附图说明图1是真菌漆酶PIE5纯化后电泳检测，M为蛋白Maker，PIE5为混合后漆酶纯蛋白。从图1中可以看出目标条带PIE5纯度较高，其大小约为61kDa。图2是以MS为介体时PIE5脱色靛蓝体系优化结果，其中A表示pH对脱色率的影响，B表示温度对脱色率的影响，C表示酶量对脱色率的影响，D表示介体浓度对脱色率的影响。从图2中可以看出，反应参数对PIE5脱色靛蓝的影响很大，pH和温度影响酶的催化活性，使脱色率呈先增后降的趋势，随酶量及介体浓度的增加脱色率呈先增后趋于平稳的趋势。图3是以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌漆酶突变体PIE5，其特征在于：是以定向进化手段对灰盖鬼伞漆酶Lcc9进行改造，构建突变文库，结合三轮筛选方法，获得的漆酶突变体，以提高漆酶的应用能力。

【技术特征摘要】
1.一种真菌漆酶突变体PIE5，其特征在于：是以定向进化手段对灰盖鬼伞漆酶Lcc9进行改造，构建突变文库，结合三轮筛选方法，获得的漆酶突变体，以提高漆酶的应用能力。2.根据权利要求1所述的真菌漆酶突变体PIE5，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。3.根据权利要求1所述的真菌漆酶突变体PIE5，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。4.一种表达权利要求1、2或3所述的真菌漆酶突变体PIE5的菌株，其特征在于：所述菌株的分类命名为PichiapastorispPIC9K-PIE5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年7月19日，保藏编号为CCTCCNO：M2018451。5.一种权利要求1、2或3所述的真菌漆酶突变体PIE5的用途，其特征在于：所述真菌漆酶突变体PIE5在染料脱色过程中作为脱色氧化剂的应用。6.一种权利要求1、2或3所述的真菌漆酶突变体PIE5的应用，其特征在于：所述真菌漆酶突变体PIE5在染料脱色过程中作为脱色氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖亚中，尹强，方泽民，张学成，房伟，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34