一种细胞和组织冻存保护剂及其冻存方法技术

本发明专利技术涉及一种组织冻存保护剂，属于细胞生物学领域。具体公开了一种组织冻存保护剂，所述组织冻存保护剂包括支架材料，所述支架材料包括海藻酸钠溶液和钙离子溶液；所述海藻酸钠溶液和钙离子溶液分别独立设置。所述的组织冻存保护剂能够辅助保护原代神经组织抵御冷冻刺激，最大限度的保证神经元冻存活性。

A Cryoprotectant for Cells and Tissues and Its Cryopreservation Method

The invention relates to a tissue cryoprotectant, which belongs to the field of cell biology. Specifically disclosed is a tissue freezing protectant, the tissue freezing protectant comprises a scaffold material, the scaffold material comprises a sodium alginate solution and a calcium ion solution; the sodium alginate solution and a calcium ion solution are separately arranged. The tissue cryoprotectant can assist in protecting primary nerve tissue against freezing stimulation and maximize the survival of neurons.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞和组织冻存保护剂及其冻存方法
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种神经元冻存保护剂。
技术介绍
在围绕神经系统的研究中，神经元的原代分离培养是非常重要的体外工具，用于研究神经细胞的各种生理功能，由于神经组织获得的局限性，关于神经元原代分离主要是在啮齿动物上进行，无法完全模拟人类神经元的诸多特性，而且，由于人类神经组织不易获得，且神经元细胞属于终末分化的细胞类型，没有增殖能力，因此，能冻存使用不易获得的人神经细胞组织，可极大的发挥有限组织细胞的使用率。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。目前细胞的冻存已经较为普遍，对于肿瘤细胞系的保存方法通常采用冻存方法保存，但是对于正常细胞的保存，尤其是神经细胞的保存通常存在不易冻存，且复苏后无法进行原代细胞培养或者培养效率低等缺点。而对于组织样品的保存，相比于细胞的保存更加不易，由于组织在冷冻过程中容易形成冰晶破坏细胞活性，采用组织冻存后通常进行分子生物学方面的形态表达分析，而无法做到原代细胞的培养。中国专利CN107494516A公布了一种小鼠脑片冻存液，该冻存液中包含蔗糖，缓冲盐以及乙二醇，通过冻存处理后得到的脑组织通过免疫组化实验证明脑片的形态和结构完好，属于一种组织化学保存液，即无法分离神经细胞进行原代培养活细胞。在现有技术中，针对非肿瘤类组织细胞的冻存保护方法研究还很有限，实现冻存后的组织依然保持原代细胞培养活性的难度也还很大。
技术实现思路
基于现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于海藻酸钠钙交联支架材料的冻存保护剂，可明显提高原代神经元组织的冻存效果。本专利技术一个方面提供了一种组织冻存保护剂，所述组织冻存保护剂包括支架材料，所述支架材料包括海藻酸钠溶液和钙离子溶液；所述海藻酸钠溶液和钙离子溶液分别独立设置。在本专利技术的技术方案中，海藻酸钠溶液中海藻酸钠质量浓度为0.01-10％，优选为0.1-3％，更优选为0.5％。在本专利技术的技术方案中，钙离子溶液中含钙离子浓度为10-100mM，并配置为等渗溶液，优选的，钙离子溶液中钙离子浓度为50mM氯化钙溶液。在本专利技术的技术方案中，所述组织选自人体或动物体的任意组织，优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜、胚胎，所述的脑组织更优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑组织；所述的细胞选自人体或动物体的任意细胞，优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜、胚胎，所述的脑组织更优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑组织来源的细胞。。本专利技术另一个方面提供了上述组织或细胞冻存保护剂在组织冻存预处理中的用途。本专利技术另一个方面提供了上述组织或细胞冻存保护剂作为组织冻存预处理液的用途。本专利技术另一个方面提供了一种组织或细胞冻存方法，其包括以下步骤：1)将待冻存的组织进行分割，分割后的组织任一边长小于5mm的小块；或者将细胞进行分离；或将待冻存的细胞进行分离；2)将步骤1)获得的分割后的组织浸泡在权利要求1-4任一项所述的冻存保护剂中；3)将步骤2)获得的保护后的组织放入细胞冻存液中进行冻存。在本专利技术的技术方案中，所述步骤1)中的待冻存的组织选自人体或动物体的任意组织，优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜，胚胎，所述的脑组织更优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑皮质组织；所述待冻存的细胞选自人体或动物体的任意细胞，优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜、胚胎，所述的脑组织更优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑组织来源的细胞。在本专利技术的技术方案中，步骤2)中所述的冻存保护剂分别进行浸泡，先浸泡于海藻酸钠溶液，再置于氯化钙溶液后，形成一层海藻酸钠钙交联保护层即可。在本专利技术的技术方案中，步骤3)中细胞冻存液中包含5％-15％的DMSO。在本专利技术的技术方案中，步骤3)的冻存方法为进行程序性降温后，在-80℃环境下保存12小时-24小时，然后在液氮中进行保存。在本专利技术的技术方案中，冻存的组织复苏后可以进行原代分离和培养。在本专利技术的技术方案中，根据组织的成熟程度，较成熟的组织在步骤1)之后增加消化步骤。有益效果(1)本专利技术提供的冻存保护剂，可用于人胎脑皮质或海马组织。可有利于人类样本组织一次冻存，多次解冻复苏使用，复苏后的组织依然可以进行原代细胞的分离培养和增殖，有利于人或实验动物样本的节约使用。(2)该冻存保护剂，亦适用于小鼠等实验动物的原代神经组织的冻存保护。(3)也适用于对低温冻存敏感的细胞组织的冻存保护。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1：冻存保护剂制备本实施例提供一种冻存保护剂组合物，该组合物包含海藻酸钠溶液和氯化钙溶液。分别配制海藻酸钠溶液和氯化钙溶液。海藻酸钠溶液配制：称取0.5克海藻酸钠，溶于100毫升水，充分溶解后，分装备用。氯化钙溶液配制：称取0.277克氯化钙，0.4383克氯化钠，溶于50毫升水，分装备用。实施例2：人流产胎儿脑组织皮质神经组织冻存经伦理委员会同意后，取人流产胎儿脑皮质，低温运回实验室，充分清洗后，将组织块切割为5毫米大小的小块，浸泡于海藻酸钠溶液后，静置1-5分钟，置于氯化钙溶液后，即形成一层海藻酸钠钙交联保护层。采用含10％DMSO的细胞冻存液中，放入程序性降温盒后，置于-80度冰箱过夜后，在液氮中长期保存。在冻存后，将含组织的冻存管从液氮中取出，在37℃水浴快速融化，用70％酒精充分消毒冻存管外壁，放入超净台内，小心打开冻存管盖子，移出冻存组织，用5倍体积含10％血清的DMEM培养基，润洗三遍。然后用1ml枪头将组织块吹打成单细胞状，接种于培养皿中，待其贴壁后，更换常规的以Neurobasal培养基为基础的神经细胞培养基。实施例3细胞活性检测由于原代神经元对外界环境的敏感性，不良刺激后极易死亡，所以神经组织的原代细胞体外实验中，一般都是现用现分离新鲜组织培养，若按实施例2描述方法，不用海藻酸钠钙交联保护层加以预处理保护，冻存复苏的神经元细胞几乎都会死亡。因此，这里分别对实施例2冻存复苏后的组织细胞，与新鲜组织原代培养细胞(对照组)进行MTT细胞活性检测。MTT具体条件为，将上述2组细胞以每平方厘米5000个细胞密度，取0.1毫升加入96孔板，每组设4个平行孔，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24小时后，每孔加入MTT20微升，继续温育4小时。然后小心除去上清后，每孔加入0.15毫升二甲基亚砜，使生成的结晶完全溶解后，在自动酶标测定仪上测光密度值(波长为570纳米)。对照组和保护剂组光吸收值分别为0.1753±0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组织或细胞的冻存保护剂，所述冻存保护剂包括支架材料，所述支架材料包括海藻酸钠溶液和钙离子溶液；所述海藻酸钠溶液和钙离子溶液分别独立设置。

【技术特征摘要】
1.一种组织或细胞的冻存保护剂，所述冻存保护剂包括支架材料，所述支架材料包括海藻酸钠溶液和钙离子溶液；所述海藻酸钠溶液和钙离子溶液分别独立设置。2.根据权利要求1所述的组织或细胞的冻存保护剂，海藻酸钠溶液中海藻酸钠质量浓度为0.01-10％，优选为0.1-3％，更优选为0.5％。3.根据权利要求1所述的组织或细胞的冻存保护剂，钙离子溶液中含钙离子浓度为10-100mM，并配置为等渗溶液，优选的，钙离子溶液中钙离子浓度为50mM氯化钙溶液。4.根据权利要求1所述的组织或细胞的冻存保护剂，所述组织选自人体或动物体的任意组织，优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜、胚胎，所述的脑组织更优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑组织；所述的细胞选自人体或动物体的任意细胞，优选为脑组织、肌肉组织、肿瘤组织、卵巢，子宫内膜、胚胎，所述的脑组织更优选为脑皮质或海马组织或胚胎期脑组织来源的细胞。5.一种细胞或组织的冻存方法，其包括以下步骤：1)将待冻存的组织进行分割，分割后的组织任一边长小于5mm的小块；或者将细胞进行分离；或将待冻存的细胞进行分离；2)将步骤1)获得的分割后的组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：张键，赵华山，杨雅莉，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44