一种异二聚体蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种异二聚体蛋白，所述的异二聚体蛋白包含两个CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白。本发明专利技术的异二聚体蛋白可防止Fc错配，避免同二聚体形成，并且收率高、稳定性好。

A heterodimer protein and its preparation method

The present invention provides an isodimer protein. The isodimer protein contains two interacting polypeptides of CH3 region, in which the CH3 region of the first polypeptide and the CH3 region of the second polypeptide introduce amino acid mutation, and form polar interaction amino acid pairs on the interaction surface to form specific interaction of the isodimer protein. The heterodimer protein of the invention can prevent Fc mismatch, avoid the formation of homodimer, and has high yield and good stability.

【技术实现步骤摘要】
一种异二聚体蛋白及其制备方法
本专利技术涉及一种异二聚体蛋白，包括组成异二聚体蛋白的单独的多肽、编码这些多肽的核酸序列，本专利技术还涉及形成异二聚体蛋白的方法。技术背景抗体靶向药物具有特异性高、副作用小、半衰期长等优势，是一种非常具有发展前途的生物治疗的方法。目前FDA已批准超过48种抗体药物用于临床疾病治疗，有超过17种抗体药物批准用于肿瘤临床治疗，更多的抗体候选药物正在进行临床前及临床研究。目前，抗体靶向药物已逐渐成为肿瘤临床治疗的重要手段。然而，由于肿瘤发生、发展的复杂性和多因素性，决定了仅仅依靠单一靶标的单靶向抗体很难取得更好的疗效。因此，绝大多数的患者在治疗过程中逐渐产生耐受和复发。因此，迫切需要研发具有更好疗效的靶向抗体用于临床疾病治疗。双/多靶向抗体由于能够靶向多个靶点，具有比单靶向抗体更好的临床应用潜力，是目前靶向抗体研究领域的热点。自然状态下不存在双/多特异性抗体，只能通过特殊方法进行制备。目前FDA已经批准的两个双靶向抗体药物Blinatumomab和Catumaxomab，分别是借助基因工程方法和杂交瘤技术制备的双特异性抗体。然而，由于杂交瘤法生产的双特异抗体，其轻链、重链随机配对产生的多种可能抗体形式，使得双特异抗体生产、纯化变得非常困难。而且，这种大鼠与小鼠杂交瘤生产的双特异性抗体，由于是异种来源，极大限制了其在临床的疗效。因此，目前绝大多数进行临床试验的双靶向抗体药物都是采用基因工程技术进行制备。众所周知，全抗体IgG的结构在临床治疗中具有很多优势，对抗体诱导的ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)/ADCP(抗体依赖的细胞介导的吞噬作用)杀伤、抗体在肿瘤组织的扩散以及抗体的半衰都具有非常重要的作用。目前Knobs-into-Holes(KIH)技术是制备具有类似全抗体IgG结构双/多特异性抗体的主要技术之一。KIH技术是将Fc中的两个CH3区域接触面进行氨基酸突变，在一侧CH3接触面区域将一个侧链小的氨基酸突变成一个侧链大的氨基酸，同时将另一侧CH3接触面区域的某些氨基酸突变成侧链小的氨基酸。同时，在两个CH3区域之间引入一个二硫键来进一步巩固异二聚体的结合能力。然而在他们研究结果中，依然会有大约5％形成同二聚体(BrinkmannU,KontermannRE.Themakingofbispecificantibodies.MAbs.2017；9(2):182–212.)，为后续产业化生产、纯化带来一定困难。为了解决上述问题，本专利技术公开了一种异二聚体蛋白的制备方法，所涉及的异二聚体蛋白包含两个经过相应改造的CH3区域的多肽，它们相互作用促使两个包含相应改造的CH3区域多肽的异二聚体形成，防止Fc错配，避免同二聚体形成。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种异二聚体蛋白。本专利技术的另一个目的是提供一种异二聚体蛋白的制备方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种异二聚体蛋白，所述异二聚体蛋白包含两个CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白，其中，所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439D、K360E、K409D和K392D；或者第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439E、K360E、K409D和K392D。在另一优选例中，所述的氨基酸突变还包括：第一多肽的CH3区的K392C。在另一优选例中，所述的氨基酸突变还包括：第二多肽的CH3区的D399C。在另一优选例中，所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二多肽的CH3区K439D、K360E、K409D、K392D和D399C；或所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二多肽的CH3区K439E、K360E、K409D、K392D和D399C。在另一优选例中，所述异二聚体的多肽对为选自下组序列所示的多肽对之一：SEQIDNO:18所示的第一多肽和SEQIDNO:20所示的第二多肽；(注：test1-1)SEQIDNO:18所示的第一多肽和SEQIDNO:22所示的第二多肽；(注：test1-2)SEQIDNO:24所示的第一多肽和SEQIDNO:26所示的第二多肽；(注：test1-5)和SEQIDNO:24所示的第一多肽和SEQIDNO:28所示的第二多肽。(注：test1-6)。在另一优选例中，所述异二聚体蛋白为抗体蛋白或融合蛋白。在另一优选例中，所述异二聚体蛋白为双靶向抗体或双靶向融合蛋白。在另一优选例中，所述异二聚体蛋白的结构类型为下述结构之一：包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-CH2-CH3链的Y字体；包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-CH3链的Y字体；包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-Fab/scFv/融合受体或配体-CH2-CH3链的Y字体；或包含两条Fab/scFv/融合受体或配体-Fab/scFv/融合受体或配体-CH3链的Y字体。在另一优选例中，所述异二聚体蛋白包括在第一多肽的CH3区与第二多肽的CH3区之间通过氨基酸突变形成二硫键，并且所述二硫键的形成来自第一多肽的CH3区的K392C和来自第二多肽的CH3区的D399C。在另一优选例中，所述异二聚体蛋白包括抗肿瘤的抗体。在本专利技术的第二方面，提供了一种制备如本专利技术第一方面所述异二聚体蛋白的方法，所述方法中在第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对。在另一优选例中，在CH3区引入氨基酸突变的氨基酸在蛋白的空间结构上分布于两个多肽相互接触面的外周。在另一优选例中，所述方法利用第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区之间形成的正负电荷相互作用和形成二硫键相结合的方式，使得所述二聚体形成。在本专利技术的第三方面，提供了一种药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂中包含：(i)如本专利技术第一方面所述的异二聚体蛋白；(ii)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物或制剂选自下组：混悬制剂、液体制剂或冻干制剂。在另一优选例中，所述液体制剂为水针制剂。在另一优选例中，所述液体制剂的保存期限为一年至三年，较佳地一年至两年，更佳地一年。在另一优选例中，所述液体制剂的保存温度为0℃-16℃，较佳地0℃-10℃，更佳地2℃-8℃。在另一优选例中，所述冻干制剂的保存期限为半年至两年，较佳地半年至一年，更佳地半年。在另一优选例中，所述冻干制剂的保存温度为≤42℃，较佳地≤37℃，更佳地≤30℃。在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂、缓冲液，或其组合。在另一优选例中，所述溶液稳定剂选自下组：糖类溶液稳定剂、氨基酸类溶液稳定剂、醇类溶液稳定剂，或其组合。在另一优选例中，所述糖类溶液稳定剂选自下组：还原性糖类溶液稳定剂或非还原性糖类溶液稳定剂。在另一优选例中，所述氨基酸类溶液稳定剂选自下组：谷氨酸单钠或组氨酸。在另一优选例中，所述醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异二聚体蛋白，其特征在于，所述异二聚体蛋白包含两个CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白，其中，所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439D、K360E、K409D和K392D；或者第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439E、K360E、K409D和K392D。

【技术特征摘要】
2017.07.21 CN PCT/CN2017/0937871.一种异二聚体蛋白，其特征在于，所述异二聚体蛋白包含两个CH3区的相互结合的多肽，其中第一多肽的CH3区和第二多肽的CH3区引入氨基酸突变，在其相互作用面上形成具有极性相互作用的氨基酸对，以形成特异性相互作用的异二聚体蛋白，其中，所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439D、K360E、K409D和K392D；或者第一多肽的CH3区的D356K、Q347K和D399K与第二多肽CH3区的K439E、K360E、K409D和K392D。2.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的氨基酸突变还包括：第一多肽的CH3区的K392C。3.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的氨基酸突变还包括：第二多肽的CH3区的D399C。4.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二多肽的CH3区K439D、K360E、K409D、K392D和D399C；或所述的氨基酸突变包括：第一多肽的CH3区D356K、Q347K、D399K和K392C与第二多肽的CH3区K439E、K360E、K409D、K392D和D399C。5.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其特征在于，所述异二聚体的多肽对为选自下组序列所示的多肽对之一：SEQIDNO:18所示的第一多肽和SEQIDNO:20所示的第二多肽；(注：test1-1)SEQIDNO:18...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵磊，张帆，
申请(专利权)人：赵磊，宝腾泰克北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11