一种外周血单个核细胞分离管及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种外周血单个核细胞分离管及其制备方法，包括管体和管塞，所述管体内部从底往上，按照比重由大到小，依次包括Ficoll‑hypaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层；所述管体中，分离胶层的上方空间用于容置样品血液。相对于现有技术，使用本发明专利技术的外周血单个核细胞分离管无需进行将血液从真空采集管中转移到锥形管中的操作，也无需进行将Ficoll‑hypaque分层液小心地注入血液下方的操作，吸取PBMCs层时也无需从液体界面小心地吸取而是可以放心大胆地从固体的分离胶界面和黄色的血浆之间吸取。从而减少了实验用具，简化了操作的过程，降低了操作的难度，也降低了不同操作者之间的不一致性。

【技术实现步骤摘要】
一种外周血单个核细胞分离管及其制备方法
本专利技术属于血液取样、分离、纯化细胞成分领域，具体涉及一种外周血单个核细胞分离管及其制备方法。
技术介绍
外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCells，PBMCs)是指外周血中具有单个细胞核的细胞，包括多种淋巴细胞和单核细胞，是免疫系统的重要组成部分。具体地，外周血单个核细胞包括约15％的B淋巴细胞、约70％的T淋巴细胞、约10％的自然杀伤细胞，以及约5％的单核细胞。目前，从全血分离得到PBMCs最经典的方法是Ficoll-hypaque密度梯度离心法。Ficoll-hypaque分层液是GE公司的产品，是一种具有一定粘度和比重的，近似于等渗的溶液。具体地，Ficoll-hypaque分层液是一种含有FicollPM400(一种蔗糖和环氧氯丙烷聚合物，易溶于水，其分子量是400000)和泛影酸钠、依地酸钙钠的混合水溶液。其中，FicollPM400具有粘度，易于聚集细胞；并且由于其分子量大并具有较低的渗透压，因此其不会透过细胞膜破坏细胞结构，也不会使细胞渗透失水。泛影酸钠的分子式如附图2所示，全称为3,5-双(乙酰胺基)-2,4,6-三碘苯甲酸的钠盐，分子量为635.92，具有光敏性。由于泛影酸钠分子量较小且为钠盐，属于离子类物质，能够对细胞的渗透压造成一定的影响，能够去除单个核细胞层中其他细胞所需的最佳密度和渗透压，从而提高单个核细胞的纯度。常用的Ficoll-hypaque分层液的比重为1.077。Ficoll-hypaque分层液分离提取血液中的PBMCs的原理为：人类静脉血中的各种细胞的比重不同，其中，红细胞的比重为1.093～1.096，粒细胞的比重为1.087～1.092，单个核细胞的比重为1.076～1.090之间，血浆的比重为1.025到1.030之间；通过离心使得血液中的各种细胞按照密度大小分层，红细胞、粒细胞位于Ficoll-hypaque分层液下方，单个核细胞位于Ficoll-hypaque分层液上方，从而实现单个核细胞的分离提取。而Ficoll-hypaque密度梯度离心法的操作过程，如附图1所示，包括以下步骤：1)静脉取血后，将血液使用含有抗凝剂的真空采血管从志愿者的静脉中抽取一定量的血液，然后轻轻的颠倒采好血的真空采血管8-10次，使抗凝剂和血液完全混合均匀；2)使用移液器将抗凝血转移到锥形管中；3)向锥形管中加入一定体积的缓冲液稀释抗凝血；4)使用移液器把Ficoll-hypaque溶液小心的加入到稀释血液的下方，注意不要使Ficoll-hypaque溶液和稀释血液混合；5)离心使得抗凝血分层，从下到上每层的成分依次是红细胞、粒细胞、Ficoll-hypaque溶液、PBMCs和血浆，即离心得到PBMCs层；6)从液体界面处小心吸取PBMCs层，收集得到PBMCs。Ficoll-hypaque分层液能够分离提取血液中的PBMCs的原理如下所示，从上述步骤中，可以看到Ficoll-hypaque密度梯度离心法存在以下几点不足：1)操作程序多且耗时长；2)把Ficoll-hypaque溶液小心放入到稀释血液的下方，而且二层要避免混合，此步骤要有很熟练的操作技能；3)离心条件的不一致，会使PBMCs的回收率和纯度存在差别；4)不同操作者即使用同样的方法分离得到PBMCs的纯度和回收率也会有不一样，重复性较差。
技术实现思路
为了克服上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种外周血单个核细胞分离管，以简化外周血单个核细胞的提取步骤、降低提取难度并提高可重复性。本专利技术的外周血单个核细胞分离管，包括管体和管塞，所述管体内部从底往上，按照比重由大到小，依次包括Ficoll-hypaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层；所述管体中，分离胶层的上方空间用于容置样品血液。相对于现有技术，使用本专利技术的外周血单个核细胞分离管无需进行将血液从真空采集管中转移到锥形管中的操作，也无需进行将Ficoll-hypaque分层液小心地注入血液下方的操作，吸取PBMCs层时也无需从液体界面小心地吸取而是可以放心大胆地从固体的分离胶界面和黄色的血浆之间吸取。从而减少了实验用具，简化了操作的过程，降低了操作的难度，也降低了不同操作者之间的不一致性。进一步地，所述分离胶的比重为1.050-1.080。进一步地，所述分离胶层中的分离胶是通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂的重量比为100:2-7:0.5-5；所述基体树脂由α-烯烃和马来酸二烷基酯两种单体在引发剂作用下聚合而成，α-烯烃、马来酸二烷基酯和引发剂的质量比为1:1-1.4:0.04-0.12；所述基体树脂的比重为1.030～1.060。α-烯烃和马来酸二烷基酯的密度差别大，可以通过调整两者的用量比例得到不同比重值的基体树脂，即得到不同比重的分离胶。另外，α-烯烃是指碳碳双键在分子链终端的烯烃，烯烃可以在引发剂的作用下进行自由基聚合反应。而在自由基聚合反应中，聚合温度可以影响聚合的速率，从而影响合成聚合物的粘度。因此，在本专利技术中可以简单地通过控制聚合温度控制分离胶的粘度。进一步地，所述引发剂为过氧化物，所述比重调节剂为粒径为5-50nm的纳米二氧化硅；所述有机凝胶剂为分子量500～10000的聚氧乙烯聚丙烯醚。无论是亲水二氧化硅还是疏水二氧化硅颗粒的表面都覆有羟基，颗粒表面的羟基会与基体树脂上带有孤对电子对的官能团，如酯基和氨基，形成氢键，从而赋予了分离胶触变性能，即在静止状态下，分离胶为固体，在振动摇晃状态下，如离心，分离胶为流体；调节分离胶中纳米二氧化硅的用量可以调节分离胶的触变性能。另外，纳米二氧化硅的比重约为2.2，远高于基体树脂的比重1.030～1.060，因此，也可以通过调节纳米二氧化硅颗粒和基体树脂的用量比例，得到不同比重的分离胶。但是，如果纳米二氧化硅量过多，在分离管离心过程中，纳米二氧化硅会从分离胶中甩出来，残留在分离得到的PBMCs层上面形成油滴，影响使用效果。聚氧乙烯聚氧丙烯醚可以通过分子间作用力，如氢健、范德华力、π-π健堆积等，自组装形成纤维状结构，这些自组装形成的纤维结构又能够缠绕在一起形成三维网络结构，以固定基底树脂形成凝胶。并且，其还能够与基体树脂、纳米二氧化硅形成氢健，从而提高分离胶中氢健的密度，有助于改善胶体的触变性能。因此，在使用聚氧乙烯聚氧丙烯醚的情况下，可以减少纳米二氧化硅的量，以使分离胶具备足够的触变性能，也避免了纳米二氧化硅甩出污染产物PBMCs层。优选地，所述基体树脂中的α-烯烃的碳原子数为6～20，马来酸二烷基酯的酯基的碳原子数为1～14。α-烯烃的碳原子多于20个时，合成的共聚物在室温下是固态；而α-烯烃的碳原子小于6个时，其沸点较低，在较高的聚合温度时易挥发，不利用共聚反应的进行。马来酸二烷基酯的酯基碳原子超过14个时，合成的共聚物具有过高的凝固点，在室温下就会成固态，并且随着酯基的碳原子个数增加时，会逐渐增加从共聚物总蒸馏出未参与聚合反应的马来酸二烷基酯的难度。优选地，所述引发剂为过氧化苯甲酸叔丁酯；所述抗凝剂为浓度为0.10～0.15mol/L的柠檬酸钠溶液。Ca2+作为一种凝血因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血单个核细胞分离管，其特征在于：包括管体和管塞，所述管体内部从底往上，按照比重由大到小，依次包括Ficoll‑hypaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层；所述管体中，分离胶层的上方空间用于容置样品血液。

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞分离管，其特征在于：包括管体和管塞，所述管体内部从底往上，按照比重由大到小，依次包括Ficoll-hypaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层；所述管体中，分离胶层的上方空间用于容置样品血液。2.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞分离管，其特征在于：所述分离胶的比重为1.050-1.080。3.根据权利要求1或2任意一条所述的外周血单个核细胞分离管，其特征在于：所述分离胶层中的分离胶是通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂的重量比为100:2-7:0.5-5；所述基体树脂由α-烯烃和马来酸二烷基酯两种单体在引发剂作用下聚合而成，α-烯烃、马来酸二烷基酯和引发剂的质量比为1:1-1.4:0.04-0.12；所述基体树脂的比重为1.030～1.060。4.根据权利要求3所述的外周血单个核细胞分离管，其特征在于：所述引发剂为过氧化物，所述比重调节剂为粒径为5-50nm的纳米二氧化硅；所述有机凝胶剂为分子量500～10000的聚氧乙烯聚丙烯醚。5.根据权利要求3所述的外周血单个核细胞分离管，其特征在于：所述基体树脂中的α-烯烃的碳原子数为6～20，马来酸二烷基酯的酯基的碳原子数为1～14。6.根据权利要求3所述的外周血单个核细胞分离管，其特征在于：所述引发剂为过氧化苯甲酸叔丁酯；所述抗凝剂为浓度为0.10～0.15mol/L的柠檬酸钠溶液。7.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞分离管，其特征在于：所述管体内壁上还设置有一层仿生膜，所述仿生膜为改性硅氧烷。8.根据权利要求4～7任意一条所述的外周血单个核细胞分离管的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1合成分离胶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琼娣，刘强，付银鑫，廖南山，马海波，林锋，李洁，
申请(专利权)人：陈琼娣，刘强，付银鑫，廖南山，马海波，林锋，李洁，
类型：发明
国别省市：广东,44