一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术的CAPS分子标记在墨绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CAPS分子标记在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。用于检测所述的CAPS分子标记的引物组，由如SEQ ID NO:3所示的上游引物序列和SEQ ID NO:4所示的下游引物序列组成。用该引物组鉴定西瓜果皮底色，包括以下步骤：基因组DNA提取，PCR扩增，BccI酶酶切，电泳判断。本发明专利技术的CAPS分子标记特异性高，对105份西瓜种质资源进行果皮底色的鉴定，结果显示，该分子标记对墨绿色和绿色果皮底色鉴定的准确率为100%，说明该分子标记可快速准确的鉴定西瓜果皮底色，加速育种进程。

A CAPS Molecular Marker for Identification of Watermelon Peel Base Color and Its Application

The nucleotide sequence of the CAPS molecular marker in the dark green peel background watermelon is shown as SEQ ID NO:1, and the nucleotide sequence of the CAPS molecular marker in the green peel background watermelon is shown as SEQ ID NO:2. The primer group for detecting the CAPS molecular marker consists of the upstream primer sequence as shown in SEQ ID NO:3 and the downstream primer sequence as shown in SEQ ID NO:4. The primers were used to identify the base color of watermelon peel, including the following steps: genomic DNA extraction, PCR amplification, BccI digestion, electrophoresis judgment. The CAPS molecular marker of the present invention has high specificity. 105 watermelon germplasm resources were identified for their peel base color. The results show that the accuracy of the CAPS molecular marker in identifying dark green and green peel base color is 100%, indicating that the CAPS molecular marker can quickly and accurately identify the peel base color of watermelon and accelerate the breeding process.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种用于鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记及其应用。技术背景在传统的植物育种过程中，由于难以获得植物后代的基因型，通常只能根据植物的表现型进行田间的筛选鉴定及后续的培育。这种选择耗时较长，容易受环境的影响，依赖于育种工作者的经验限制，导致育种时间较长且与基因型有偏离，选择效率低，选择准确性较差。分子标记辅助育种基于与相关基因连锁的分子标记或者基因本身特异性标记进行选择，效率高，准确性高，不受环境因素干扰，在生产上已经被证实是非常有经济效益的。通过分子标记辅助育种可快速的对目标性状的前景和遗传材料的背景进行选择，极大地提高选择效率，缩短育种时间。西瓜是一种重要的园艺作物，作为世界十大水果之一在世界范围内广泛种植，我国是世界第一的西瓜生产和消费大国，加速西瓜产业育种过程具有重要的经济和生产意义。然而目前我国西瓜的育种过程仍以传统的与育种为主，可用于实际生产和育种的分子标记较少，育种效率较低，阻碍了西瓜的育种进程。早在上世纪三十年代末，Weetman(1937)等育种工作者就根据传统的遗传分析对西瓜果皮底色的遗传规律进行了预测。随着西瓜参考基因组的发布和高通量测序技术的发展，Yang(2015)通过构建遗传图谱的方法定位到三个独立的位点，提出了三点模型，及西瓜果皮颜色受三个独立的基因控制，即S(foregroundstripe)控制果皮条纹，D(deepcolorvs.standardcolor)控制颜色深度，Dgo(backgroundcolor)控制果皮背景颜色。西瓜绿色相关果皮底色(墨绿色、绿色)在西瓜品种中占主要地位，目前还未有关于区分墨绿色和绿色两种西瓜最常见果皮底色的分子标记的报道。目前关于西瓜果皮底色的研究报道较少，西瓜果皮底色的选育工作主要还是通过传统的育种方法进行表型鉴定，效率低且易受环境影响。因此开展西瓜果皮底色的研究，开发与西瓜性状紧密连锁的分子标记，通过分子辅助育种可以极大地缩短育种工作的时间和提高育种选择的准确性。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种可以快速准确地鉴定墨绿色和绿色果皮底色西瓜的CAPS分子标记。本专利技术提供的分子标记具有检测方便、扩增产物稳定、特异性高的特点。本专利技术的另一目的是提供一种检测上述标记的引物组。本专利技术的再一目的是提供一种鉴定西瓜果皮底色的方法。本专利技术的解决方案如下：本专利技术提供一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记，记为RC-1D，其在墨绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术的CAPS分子标记RC-1D，在墨绿色和绿色果皮底色西瓜中的序列的395bp处存在一个G→C的SNP位点不同，本专利技术对比了大量西瓜品种的CAPS分子标记RC-1D，结果证明其与果皮底色性状完全连锁，显示本专利技术提供的特异性分子标记RC-1D可用来鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色。因此，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的特异性分子标记RC-1D在鉴定西瓜果皮底色中的应用在本专利技术的保护范围内。一种用于检测上述特异性分子标记RC-1D的引物组，引物序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；其中上游引物(SEQIDNO:3)：5’-GCCCGCCTGTTGAAAATTCC-3’；下游引物(SEQIDNO:4)5’-CCAACGTTCCCTCTCCAACT-3’。上述引物组可作为扩增CAPS分子标记的引物组，进而用于鉴定西瓜果皮底色，因此，所述引物组在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色中的应用在本专利技术的保护范围内。而且，包含上述的引物组、用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒也在本专利技术的保护范围内。利用上述引物组鉴定西瓜果皮底色的方法，包括以下步骤：步骤1：提取西瓜组织的基因组DNA；步骤2：以上述的引物组对步骤1得到的基因组DNA进行PCR扩增；步骤3：将步骤2的PCR扩增产物经BccI酶切后电泳，得到酶切产物；步骤4：若酶切产物为715bp一条电泳条带或者715pb、403bp和312pb三条电泳条带，则该西瓜样品为墨绿色果皮底色，若得到403bp和312pb两条电泳条带则该西瓜为绿色果皮底色。所述PCR扩增的反应体系为：2×PCRMix12.5μL、DNA2μL、上游引物1.25μL、下游引物1.25μL，补充去离子水至25μL。所述PCR的反应程序为：94℃1min30sec；94℃20sec，57℃20sec，72℃50sec，共30个循环；72℃5min；4℃保存。在墨绿色果皮底色和绿色果皮底色西瓜的核苷酸序列中，本专利技术的特异性CAPS分子标记RC-1D存在一个SNP位点变化(G→C)，绿色果皮底色的西瓜在该位点傍序列可被限制性内切酶BccI识别，酶切识别序列为CCATC(N)4。墨绿色果皮底色的西瓜因为发生SNP变化，造成在该位点的序列GCATC(N)4无法被限制性内切酶BccI识别。PCR扩增产物经BccI限制性内切酶识别并酶切后，墨绿色纯合材料保持715bp的DNA片段大小，杂合材料有715bp、403bp和312bp三种大小的DNA片段；绿色果皮底色的西瓜被酶切为403bp、312bp大小的DNA片段。所以，上述特异性CAPS分子标记RC-1D还可以用来检测西瓜材料关于果皮底色性状基因型的纯合度，本专利技术所述特异性CAPS分子标记RC-1D在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色性状基因型纯度中应用在本专利技术的保护范围内。与现有技术相比，本专利技术具有以下积极有益效果：1、本专利技术利用全基因组重测序技术(WGR)获得了控制西瓜果皮底色(墨绿色/绿色)性状的确切基因区间，并通过F2群体实现目的基因的精细定位，开发出与目的性状紧密连锁的CAPS标记，该标记为共显性标记，可用于西瓜分子标记辅助选择育种，提高育种效率，加速育种过程。2、本专利技术的CAPS分子标记RC-1D，特异性强，可用于鉴定墨绿色和绿色西瓜果皮底色，在鉴定过程中稳定性强，灵敏度高，不受环境因素的影响，可广泛地用于西瓜果皮底色的鉴定中，适合用于生产实践。3、该方法适用于各个生育期的西瓜果皮底色的鉴定，特异性高、通量大，可在苗期鉴定出所需的植株，不仅节省了育种所需的人力物力，而且提高了育种的效率。附图说明图1为特异性CAPS分子标记RC-1D在105份西瓜种质资源中的验证结果图。图中电泳条带由左到右、从上至下依次对应表1中的1～105的西瓜品种，最后两个样品分别是亲本9904和Handel。图2为特异性CAPS分子标记RC-1D在9904和Handel构建的F2群体中的部分验证结果图。图中有三条带的表示杂合植株。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特殊说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为为本
常规试剂、方法和设备。实施例1、鉴别西瓜果皮底色的CAPS分子标记和引物的开发首先通过构建高密度遗传图谱进行皮色相关基因的精细定位，具体如下：通过对重组自交系126个单株及其亲本(9904为母本，Handel为父本)进行重测序，构建了一张西瓜高密度遗传图谱，亲本间共检测到178762个适用于RILs且深本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记，其特征在于，所述的CAPS分子标记在墨绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CAPS分子标记在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记，其特征在于，所述的CAPS分子标记在墨绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，CAPS分子标记在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的分子标记在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色中的应用。3.一种用于检测权利要求1所述的CAPS分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组由如SEQIDNO:3所示的上游引物序列和SEQIDNO:4所示的下游引物序列组成。4.权利要求3所述的引物组在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色中的应用。5.用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物组。6.利用权利要求3所述引物组鉴定西瓜果皮底色的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：提取西瓜组织的基因组DNA；步骤2：以权利要求3所述的引物组对步骤1得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兵兵，刘文革，路绪强，赵胜杰，何楠，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41