一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用技术

一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用,植物病毒疫苗技术领域。本发明专利技术针对目前马铃薯X病毒属病毒弱毒疫苗存在的保护品种受限，易回复突变的问题，通过分子生物学技术手段完全敲除马铃薯X病毒中编码“GGXYXDGTK”氨基酸基序(其中，X为任意一种氨基酸)的核苷酸序列，获得一种改造的弱毒疫苗，缺失该段多肽的改造病毒具有系统侵染植物的能力，且不会引起和健康对照植物相比可分辨的病毒症状。本发明专利技术适用于植物弱毒疫苗的开发和利用。

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用
本专利技术涉及植物病毒疫苗
，提供了一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
利用低致病力(弱毒)的植物病毒来防治高致病力株系在农业上具有重要的应用价值。目前，弱毒株系主要通过以下几种方式获得：1)从自然环境中筛选获得弱毒株系；例如：REGULESMiguelARANDASempereRaquelPedroJesúsUseoftwoisolatesofpepinomosaicvirustoprotectagainstinfectionbythesamevirus(EP3309256A1)；SchenkMF,HamelinkR,vanderVlugtRAA,VermuntAMW,KaarsenmakerRC,Stijger,ICCMM.2010,Theuseofattenuatedisolatesofpepinomosaicvirusforcross-protection.Europeanjournalofplantpathology,127:249-261。2)人工改造病毒氨基酸获得弱毒株系。例如：李向东，丛倩倩，王莹，郭兆奎，李现道，马铃薯X病毒弱毒株系的筛选及在交叉保护中的应用(CN103820400B)；ChewachongGM,MillerSA,BlakesleeJJ,FrancisDM,MorrisTJ,QuF.2015.Generationofanattenuated,cross-protectivepepinomosaicvirusvariantthroughalignment-guidedmutagenesisoftheviralcapsidprotein.Phytopathology105:126-134.上述方法中，从自然界分离的弱毒系可能仅在少数作物品种上具有保护功能，而在其它品种或作物上并不是弱毒株系，而且存在逃逸的风险；人工改造病毒氨基酸获得弱毒株系存在回复突变为强毒株系的可能。
技术实现思路
针对现有技术制备的马铃薯X病毒属病毒(potexviruses)弱毒疫苗存在的保护品种受限，易回复突变的问题，本专利技术提供了一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用。本专利技术提供了一种通过敲除马铃薯X病毒中编码“GGXYXDGTK”的核苷酸序列，获得低复制能力、弱毒性的马铃薯X病毒弱毒疫苗的方法。本专利技术所述马铃薯X病毒弱毒疫苗为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌。进一步地限定，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA序列如SEQIDNO：1所示。进一步地限定，所述农杆菌为带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101。进一步地限定，所述侵染性克隆所用的表达载体为pGR107。本专利技术还提供了所述马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)获取马铃薯X病毒基因组全长cDNA；2)构建马铃薯X病毒弱毒疫苗：对上述全长cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列进行敲除，构建到表达载体中获得改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆；或者将改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆转化宿主菌，获得重组菌，即为马铃薯X病毒疫苗，所述宿主菌为农杆菌。进一步地限定，步骤2)中所述改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆的构建方法如下：a.以带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆为模板，经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的3919-5350nt，记为序列A，核苷酸序列如SEQIDNo：2所示；经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的5276-6158nt片段，记为序列B，核苷酸序列如SEQIDNo：3所示；其中，序列A和序列B均全部缺失编码GGXYXDGTK基序的核苷酸，即缺失马铃薯X病毒基因组cDNA5300-5326nt片段，序列A的3′末端和序列B的5′末端存在48nt的重复序列；b.将序列A和序列B通过线性PCR反应进行连接；以线性PCR产物为模板，PCR扩增获得序列C，核苷酸序列如SEQIDNo：4所示；c.用限制性内切酶AvrII和HpaI对带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆进行酶切，回收大小为8892nt的片段，记为序列D；d.将序列C插入至序列D中，构建完全敲除三基因盒蛋白2中编码GGXYXDGTK基序的核苷酸的马铃薯X病毒突变体，命名为pGR107-TGBp2Δ52-60，即为侵染性克隆。更进一步地限定，步骤a中所述序列A扩增用的引物对如SEQIDNo:5和SEQIDNO：6所示；所述序列B扩增用的引物对如SEQIDNo:7和SEQIDNO：8所示；步骤b)所述序列C扩增用的引物如SEQIDNo:5和SEQIDNO：8所示。更进一步地限定，步骤d中所述序列C通过Gibson组装的方法插入至序列D中。本专利技术还提供了上述马铃薯X病毒弱毒疫苗在交叉保护中的应用，将所述含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的重组菌导入植物，使植物接种马铃薯X病毒弱毒疫苗，所述植物为马铃薯X病毒的寄主植物，包括马铃薯、番茄、辣椒、烟草、黄瓜和西瓜。有益效果本专利技术利用一段来自于马铃薯X病毒的9个氨基酸长度的多肽序列，位于马铃薯X病毒属病毒编码的三基因盒蛋白2(Triple-gene-blockprotein2，TGB2或TGBp2)中，氨基酸序列为“GGXYXDGTK”(其中，X为任意一种天然氨基酸)，该多肽具有以下特征：1)由马铃薯X病毒的TGBp2基因编码；2)在马铃薯X病毒的TGBp2蛋白中的一致氨基酸序列为“GGXYXDGTK”(其中，X为任意一种天然氨基酸)。本专利技术通过分子生物学技术手段完全敲除马铃薯X病毒中编码该段多肽的核苷酸序列而获得的改造病毒具有较未改造前病毒显著低的复制能力；缺失该段多肽的改造病毒具有系统侵染植物的能力，但不能引起和健康对照植物相比可分辨的病毒症状，即可正常侵染植物但不能造成任何病毒症状，并且感染缺失该段多肽的马铃薯X病毒的植物对原始高致病力的病毒具有保护作用，说明缺失该段多肽的马铃薯X病毒具有弱毒疫苗的应用价值。综上，本专利技术取得的有益效果如下：1.本方法采用缺失TGBp2蛋白中的一段氨基酸序列构建马铃薯X病毒弱毒株，相对于过去仅改变1或少数几个氨基酸的方法更加稳定，不会出现回复突变。2.和自然界筛选的弱毒株相比，本方法构建的马铃薯X病毒弱毒株在本氏烟上不引起任何病毒的症状，也不影响本氏烟的生长、发育、开花以及种子量，因此具有更好的应用潜力。3.采用相同的策略，本方法可应用于所有现已知的马铃薯X病毒属病毒的弱毒株构建。附图说明图137种马铃薯X病毒属病毒编码的TGBp2蛋白的“GGXYXDGTK”序列比较。图2野生型和马铃薯X病毒弱毒疫苗(PVX-TGBp2Δ52-60)感染本氏烟草6天时的症状比较，左一所示Mock为阴性对照组，左二所示pGR107为阳性对照组，左三所示PVX-TGBp2Δ52-60为实验组。图3野生型和马铃薯X病毒弱毒疫苗(PVX-TGBp2Δ52-60)感染本氏烟草6天时的RT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌。2.根据权利要求1所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA序列如SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求1所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，所述农杆菌为带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101。4.根据权利要求1所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，所述侵染性克隆所用的表达载体为pGR107。5.权利要求1-4任意一项所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)获取马铃薯X病毒基因组全长cDNA；2)构建马铃薯X病毒弱毒疫苗：对上述全长cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列进行敲除，构建到表达载体中获得改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆；或者将改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆转化宿主菌，获得重组菌，即为马铃薯X病毒疫苗；所述宿主菌为农杆菌。6.根据权利要求5所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆的构建方法如下：a.以带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆为模板，经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的3919-5350nt，记为序列A，核苷酸序列如SEQIDNo：2所示；经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的5276-6158...

【专利技术属性】
技术研发人员：程晓非，武晓云，刘佳慧，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23