一种细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶、细胞凝胶、制备方法、使用方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞保存和再生修复技术领域，公开了一种细胞低温保存液，主要由以下质量百分含量的组分组成：0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白、3％～7％低分子右旋糖苷、0.1～0.3％谷胱甘肽、0.5％～2％益多酚、3％～5％腺苷、0.5％～1％葡萄糖、0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％CaCl2，余量为水。本发明专利技术提供了一种海藻酸钠凝胶，包括海藻酸钠、氯化钙、透明质酸和前述细胞低温保存液等，还提供了一种细胞凝胶及其制备方法，以及细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶和细胞凝胶的应用。本发明专利技术的优点在于，细胞低温保存液可在2～8℃下较长时间保持细胞活性，海藻酸钠凝胶可作为各种来源的细胞的临时短期保存材料和细胞组织工程的支架，细胞凝胶可作为医用湿性伤口敷料，用于软组织、难愈性伤口皮肤及粘膜创面损伤的修复。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶、细胞凝胶、制备方法、使用方法及其应用
本专利技术涉及细胞保存和再生修复
，具体涉及一种细胞低温保存液、利用该细胞低温保存液制备的富含三维孔隙的海藻酸钠凝胶，还涉及利用该海藻酸钠凝胶制备的细胞凝胶，同时本专利技术还涉及到该细胞凝胶的制备方法和其中的细胞的分离活化方法，此外，本专利技术还涉及细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶和细胞凝胶应用。
技术介绍
细胞广泛应用于科研和临床上，其中，细胞保存和运输是细胞应用中较为重要的部分。目前，细胞保存一般是将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验，这种方法的优点在于可保存的时间长。然而，这种保存方法存在以下问题：运输过程中细胞活性下降快，长时间运输后细胞的存活率很低，细胞大量死亡，直接影响后续的实验或临床效果；细胞复苏对操作要求高，不易活化；此外，大部分冻存液中需要添加DMSO等对组织细胞有毒性的物质，极大的限制了细胞产品的临床应用。因此，在临床医疗中，如何维持细胞活性是一项极大的挑战，在短时间内保存细胞时，往往使用生理盐水或者细胞培养基来维持细胞活性，然而细胞在生理盐水中活性降低速度非常快，在培养液中保存效果也不理想，一般为几小时。由于可保存时间短，受限较多，难以高效保存细胞生物活性，上述细胞保存方式不便于细胞的各种应用。由于细胞在低温保存液中缺乏天然细胞外结构和物质，易发生细胞膜膨胀；更多环境压力造成氧化损伤，生成大量脂质过氧化物，细胞保存液变酸；过多的生长因子和营养提高细胞基础代谢率，生成更多的代谢产物，这些代谢产物的堆积进一步损害细胞活性。这些特点导致低温保存的细胞非常容易受到细胞外环境影响，例如细胞保存液的渗透压、离子浓度、能量底物、抗凋亡和抗坏死物质，使得细胞死亡率高，复苏后状态不佳。目前，市面上有一些细胞低温保存液，是在生理盐水或培养基的基础上做一定的改进，但这类细胞低温保存液在2-8℃下仍然仅能保存1-2天左右。因此，急需开发一种组分比例适当，能应对细胞保存中的各种问题、方便临时保存或运输且保存时间长、细胞活性高的保存液。创面愈合是一个复杂的病理生理过程，大体可分为炎症反应、肉芽组织形成、表皮和其他组织再生三个阶段，是一种多细胞参与的有序的变化过程。目前，难愈或不愈创面的治疗仍是外科难题。干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，可分泌多种细胞因子，同时具有免疫调节的功能。干细胞具有促进上皮化、减小炎症反应、加快肉芽组织形成、促进血管重建等功能。目前研究表明干细胞在治疗深度皮损、糖尿病足等难愈伤口的愈合中有积极作用。目前干细胞的临床使用方式主要为静脉回输和局部注射。由于干细胞具有归巢效应，静脉回输后干细胞在趋化因子的作用下可富集于受损组织，参与组织的修复与再生。同时，也可在局部组织通过注射的方式让干细胞参与受损组织的修复和再生。对于局部软组织或皮肤粘膜组织的损伤，选择用干细胞作为治疗手段时，采用静脉回输的方式面临着局部受损部位干细胞富集量过低的问题，采用局部注射的方式又面临着不能参与皮肤或粘膜的表面修复，同时可能造成二次损伤的问题。因此，必须采取适合的组织工程支架材料来作为干细胞的载体，让干细胞能在受损组织表面趋化因子的作用下到达创面，参与修复。随着对伤口病理生理研究的深入，伤口愈合理论由传统的“干性愈合”转向新兴的“湿性愈合”。湿性环境可以促进表皮细胞迁移，调节创面氧张力，促进毛细血管的形成，并且有利于坏死组织和纤维蛋白的溶解吸收，加速伤口愈合和减少疤痕的形成。海藻酸钠是一种从海带、马尾藻等褐海藻中分离得到的一种天然多聚糖，属于阴离子型共聚物，具有很好的生物相容性。海藻酸钠对人体组织是无毒无免疫原性的，并且可以降解，降解的产物也是无毒无免疫性的。中国1987-10-01颁布实施的卫生部标准中注明海藻酸盐可用于人体组织，美国FDA也早已批准海藻酸盐可用于人类伤口敷料。海藻酸钠可通过离子交联的方式形成含有三维孔隙的水凝胶，在一定制备工艺的条件下，制备的无菌水凝胶可均匀快速的覆盖于创面上，为创面修复提供湿性环境。采用钙离子交联形成的海藻酸钠凝胶具有三维孔隙，细胞可在其中附着生长，自由穿梭；含有三维孔隙的海藻酸钠水凝胶具有强大的快速吸收能力，有利于伤口湿性环境的保持，用钙离子交联还可以促进凝血。作为一种良好的组织工程材料，海藻酸钠盐还兼具抑制细菌生长繁殖的能力；同时，海藻糖可在恶劣环境下，在细胞表面形成一层保护膜，对细胞具有保护作用。“一种保持冻存细胞活性的干细胞凝胶及其应用”(中国专利技术专利公开号CN106538512A)，使用海藻酸钠和二甲亚砜等制备而成，该种凝胶在-80℃～-60℃冻存下可以将干细胞保存期限延长至18个月，但此种凝胶仍需在-80℃～-60℃的低温保存条件，并且添加有二甲亚砜，在使用该凝胶时还需要对凝胶(其中的细胞)完成复苏，并不方便凝胶的保存运输和临床应用。因此，急需开发一种对低温要求低、便于保存、运输或用前无需复苏的海藻酸钠凝胶或细胞凝胶，以便于促进干细胞的临床应用。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种方便临时保存或运输且保存时间长、细胞活性高的细胞低温保存液，还提供了一种可在2～8℃下较长时间保持细胞活性且可作为细胞组织工程支架方便细胞在其中穿梭的海藻酸钠凝胶，还提供了一种对温度要求低、便于保存运输、可有效治愈创面且用前无需复苏的细胞凝胶、制备方法及使用方法，还提供了前述细胞低温保存液、海藻酸钠凝胶和细胞凝胶的应用。本专利技术所采用的技术方案为：一种细胞低温保存液，主要由以下质量百分含量的组分组成：0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白、3％～7％低分子右旋糖苷、0.1～0.3％谷胱甘肽、0.5％～2％益多酚、3％～5％腺苷、0.5％～1％葡萄糖、0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％CaCl2，余量为水。本专利技术还提供了一种海藻酸钠凝胶，主要由以下质量百分含量的原料制备而成：主要由海藻酸钠高浓度溶胀液、氯化钙溶液、透明质酸溶液和前述细胞低温保存液组成；所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积比为4:1，所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积之和、氯化钙溶液和透明质酸溶液的体积比依次为2:2:3；所述海藻酸钠高浓度溶胀液由海藻酸钠和生理盐水组成，所述海藻酸钠高浓度溶胀液中海藻酸钠的质量百分含量为10％；所述氯化钙溶液由氯化钙和前述细胞低温保存液组成，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为0.2％～1.0％；所述透明质酸溶液由透明质酸和前述细胞低温保存液组成，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量百分含量为0.2％～1.0％。具体的，上述海藻酸钠凝胶，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为0.4％～0.8％。本专利技术还提供了一种细胞凝胶，由细胞和前述的海藻酸钠凝胶制备而成。具体的，所述细胞凝胶，所述细胞为干细胞。本专利技术还提供了一种前述的细胞凝胶的制备方法，包括如下步骤：(1)配置细胞低温保存液：称取NaCl、KCl和CaCl2溶于无菌水水中，混匀，灭菌，加入甘露醇、人血白蛋白、低分子右旋糖苷、谷胱甘肽、益多酚、腺苷、葡萄糖溶液稀释至使用浓度，得到所述细胞低温保存液；(2)配置海藻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞低温保存液，其特征在于，主要由以下质量百分含量的组分组成：0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白、3％～7％低分子右旋糖苷、0.1～0.3％谷胱甘肽、0.5％～2％益多酚、3％～5％腺苷、0.5％～1％葡萄糖、0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％CaCl2，余量为水。

【技术特征摘要】
1.一种细胞低温保存液，其特征在于，主要由以下质量百分含量的组分组成：0.8％～1.5％甘露醇、2％～3％人血白蛋白、3％～7％低分子右旋糖苷、0.1～0.3％谷胱甘肽、0.5％～2％益多酚、3％～5％腺苷、0.5％～1％葡萄糖、0.8％NaCl、0.2％KCl和0.1％CaCl2，余量为水。2.一种海藻酸钠凝胶，其特征在于，主要由以下质量百分含量的原料制备而成：主要由海藻酸钠高浓度溶胀液、氯化钙溶液、透明质酸溶液和权利要求1所述的细胞低温保存液组成；所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积比为4:1，所述细胞低温保存液和海藻酸钠高浓度溶胀液的体积之和、氯化钙溶液和透明质酸溶液的体积比依次为2:2:3；所述海藻酸钠高浓度溶胀液由海藻酸钠和生理盐水组成，所述海藻酸钠高浓度溶胀液中海藻酸钠的质量百分含量为10％；所述氯化钙溶液由氯化钙和权利要求1所述的细胞低温保存液组成，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为0.2％～1.0％；所述透明质酸溶液由透明质酸和权利要求1所述的细胞低温保存液组成，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量百分含量为0.2％～1.0％。3.根据权利要求2所述的海藻酸钠凝胶，其特征在于：所述氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为0.4％～0.8％。4.一种细胞凝胶，其特征在于：由细胞和权利要求2-3任意一项所述的海藻酸钠凝胶制备而成。5.根据权利要求4所述的细胞凝胶，其特征在于：所述细胞为干细胞。6.一种权利要求4-5任意一项所述的细胞凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)配置细胞低温保存液：称取NaCl、KCl和CaCl2溶于无菌水水中，混匀，灭菌，加入甘露...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨远，袁祥，韩飞，张中伟，潘红伟，
申请(专利权)人：成都远山原力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51