一种数字PCR芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割系统技术方案

本发明专利技术实施例公开了一种数字PCR芯片及其使用方法、以及基于该芯片的试剂分割系统。包括：基底层，其上表面刻蚀有指定数量的独立的微腔体；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；中间层，其下表面设置有流道，所述流道与所述微腔体相通；将所述流道与所述微腔体对准后，将所述中间层的底部与所述基底层的上表面键合；其中，所述中间层上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层由可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层由耐受高于95℃高温且透明的密封材质制成。由上，本申请在实现对PCR样品试剂的分割的基础上，又可以实现有效地防止高温液体的蒸发，且简单易操作。

A Digital PCR Chip and Its Application and Reagent Segmentation System Based on the Chip

The embodiment of the invention discloses a digital PCR chip and its use method, and a reagent segmentation system based on the chip. It includes: a base layer with a specified number of independent microcavities etched on its upper surface; the base layer is made of incompressible, impermeable and heat conductive materials; the middle layer has a flow channel on its lower surface, which communicates with the microcavity; after aligning the flow channel with the microcavity, the bottom of the middle layer is bonded with the upper surface of the base layer; The middle layer is also provided with a reagent injection port connected with the two ports of the flow channel, wherein the middle layer is made of a compressible internal porous transparent material, and the upper layer is arranged on the upper surface of the middle layer, wherein the upper layer is made of a sealing material which is resistant to high temperature and transparent above 95 ~C. On the basis of separating the sample reagent of PCR, the application can effectively prevent the evaporation of high temperature liquid and is simple and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
一种数字PCR芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割系统
本专利技术涉及生物化学与分子生物学技术应用领域，具体涉及一种数字PCR芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割系统。
技术介绍
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是指DNA在体外95℃高温下变性分解成单链，低温(通常为55至65℃)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，同时，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链。因此，通过重复此温度循环，即可以实现对目标DNA片段的指数式扩增。PCR自上世纪80年代被提出来后，极大地推动了生命科学各个领域的发展。现在，PCR已经成为了分子生物学领域的一种关键技术和常规技术。第一代传统的PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，但这种方法只能获得半定量的结果。第二代PCR，即实时荧光定量PCR，通过在反应体系中加入荧光探针或染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值(cyclethreshold，Ct)，来计算目标核酸序列的含量。因为实时荧光定量PCR依赖于Ct值和标准曲线，所以其定量依然是相对的。当目标DNA含量低或反应体系中含有大量背景序列或抑制物等情况下，实时荧光定量PCR的灵敏度和准确度都会受到很大的影响。如今，PCR技术已经发展至第三代，即数字PCR。数字PCR是在有限稀释的条件下将反应体系均匀分配至大量的反应单元中，使得每个反应单元只存在不包含或至多包含一个目标DNA两种情况，然后对所有单元独立地进行扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，并根据泊松分布和荧光信号阳性反应单元所占比例来计算目标DNA的拷贝数。因此，数字PCR真正意义上地实现了对目标DNA的绝对定量，其在分子生物学领域的发展趋势已经势不可挡。数字PCR的关键在于两点，一是均匀地将样本分配至大量的反应单元；二是在升降温过程中保持反应单元内液体的稳定性。目前进行数字PCR的方法主要分为液滴式和芯片式，此二者各有自己独特的优势。对于芯片式而言，大多是采用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)通过软光刻的方法制成反应腔室和流道，然后利用负压的方式进样，并采用油相分割液相的方式将样品分割并封闭在各个小腔室内，然后进行PCR。然而，因为PDMS是一种疏松多孔的材料，具有透气性，水分子可以透过PDMS扩散至外界。而在PCR过程中，DNA的变性温度为95℃，已经接近水的沸点，这就导致大量的水分子透过PDMS蒸发掉了，最终导致PCR失败。为了解决该技术问题，现有的技术采用了如下两种方法：1、在芯片上下面设置玻璃片；虽然玻璃片是不透气的，即水分子不会透过芯片的上下表面蒸发，但是芯片的四周是没有任何防护的。当温度升高时，芯片内的水就会通过PDMS的四周蒸发掉，导致PCR失败。2、在PDMS表面镀膜，一般都是镀一层派瑞林(Parylene)或者其他不透气且透明的薄膜。但是这种方法不仅增加了制造成本，而且防蒸发的效果并不好。此外，通过油相分割液相的方法还需要很好地密封住芯片的出口和入口，以防止高温高压下油水界面被破坏。因此，这种方式本身就具有一定的不稳定性，而且操作比较复杂。因此，目前亟需一种数字PCR芯片及其使用方法，在实现对PCR样品试剂的分割的基础上，又可以实现有效地防止高温下液体的蒸发，且简单易操作。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供了一种数字PCR芯片及其使用方法以及基于该芯片的试剂分割系统，在实现对PCR样品试剂的分割的基础上，又可以实现有效地防止高温下液体的蒸发，且简单易操作。本专利技术提供一种数字PCR芯片，包括：基底层，其上表面刻蚀有指定数量的独立的微腔体；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；中间层，其下表面设置有流道，所述流道与所述微腔体相通；将所述流道与所述微腔体对准后，将所述中间层的底部与所述基底层的上表面键合；其中，所述中间层上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层由可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层由耐受高于DNA变性温度且透明的密封材质制成。由上，本专利技术将微腔体设计在由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成的基底层上，并将其和可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成的中间层结合起来，通过向下压中间层，将其上的流道压塌以使其中的试剂挤出，以完成样品液体在各个微腔体的分割。因为基底为导热性能良好的材质，所以可以利用一温控装置通过基底传热来对微腔体内部的PCR液体进行升温和降温的控制。使用透明材质是为了有利于观察微腔体的进样情况和微腔体内PCR试剂荧光强度。与传统的油相分割液相的方式相比，这种方式的优点包括：1.不需要用油，节约了成本，且操作更加简便。2.这种分割方式不用担心芯片在高温高压下油水界面稳定性的问题，因此更加稳定。同时，本申请减小了微腔体内样品液体与中间层的接触面积，而基底层是不透气的，所以样品液体不会透过基底层向下或者向四周蒸发掉。因为上层为密封层，同时中间层受压后，其内部密度变大，使得液体透过中间层蒸发掉的几率降低。使得本专利技术所提出的芯片在高温情况下依然能保证样品液体很好地被限制在微腔体内部，而不受蒸发的影响。克服了传统的数字PCR芯片一般将微腔体设计在PDMS上，导致温度循环过程中，大量PCR液体中的水透过PDMS蒸发掉了的缺陷。其中，基底层上表面刻蚀的微腔体的形状可以为方形、圆形或其他任意形状。优选地，所述流道包括：主流道和分支流道；其中，所述主流道的两端与所述试剂注入口连接相通；所述分支流道与所述微腔体连接相通；其中，每一所述分支流道的全部或者部分与其相通的微腔体相接。由上，如图2所示，流道包括主流道201和分支流道203，为本申请的一种芯片结构(流道设置方式为分为主流道和分支流道)。优选地，所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道覆盖每一所述微腔体方式设置；或者所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道部分覆盖每一所述微腔体方式设置。由上，为另外两种芯片结构(流道设置方式不同)，如图3中的(c)所示，为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道覆盖每一所述微腔体的方式设置；以及，如图3中的(a)和(b)所示，为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道部分覆盖每一所述微腔体方式设置。优选地，所述流道为覆盖全部所述微腔体的整个区域的一流道。由上，如图3中的(d)所示，为本申请的另一种芯片结构。本申请还提供一种基于上述的芯片PCR样品试剂分割系统，在基于上述芯片结构的基础上还包括：进样装置，用于将试剂样品从所述试剂注入口注入；一容器，用于将所述基底层、所述中间层及所述上层组成的芯片结构容纳于其中；一排气装置，与所述容器连接，用于对所述容器抽真空；一进气装置，与所述容器连接，用于在所述排气装置对所述容器抽真空一指定时间之后向所述容器内通气。由上，在样品进样后，通过排气装置抽真空排气一指定时间后，由进气装置向真空容器内通气；可以使得PCR样品试剂在气体压力作用下流向处于负压状态的芯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种数字PCR芯片，其特征在于，包括：基底层，其上表面刻蚀有指定数量的独立的微腔体；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；中间层，其下表面设置有流道，所述流道与所述微腔体相通；将所述流道与所述微腔体对准后，将所述中间层的底部与所述基底层的上表面键合；其中，所述中间层上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层由可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层由耐受高于DNA变性温度且透明的密封材质制成。

【技术特征摘要】
1.一种数字PCR芯片，其特征在于，包括：基底层，其上表面刻蚀有指定数量的独立的微腔体；所述基底层由不可压缩的不透气且导热性好的材质制成；中间层，其下表面设置有流道，所述流道与所述微腔体相通；将所述流道与所述微腔体对准后，将所述中间层的底部与所述基底层的上表面键合；其中，所述中间层上还设置有与所述流道的两端口相通的试剂注入口；其中，所述中间层由可压缩的内部疏松多孔的透明材质制成；上层，设置于所述中间层的上表面；其中，所述上层由耐受高于DNA变性温度且透明的密封材质制成。2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述流道包括：主流道和分支流道；其中，所述主流道的两端与所述试剂注入口连接相通；所述分支流道与所述微腔体连接相通；其中，每一所述分支流道的全部或者部分和与其相通的微腔体相接。3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道覆盖每一所述微腔体的方式设置；或者所述流道为沿着所述微腔体的设置的多条流道，每条流道和与其所相通的微腔体采用流道部分覆盖每一所述微腔体方式设置。4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述流道为覆盖全部所述微腔体的整个区域的一流道。5.一种基于权利要求1所述芯片的PCR样品试剂分割系统，其特征在于，在基于所述芯片结构的基础上还包括：进样装置，用于将试剂样品从所述试剂注入口注入；一容器，用于将所述基底层、所述中间层及所述上层组成的芯...

【专利技术属性】
技术研发人员：段学欣，何美杭，
申请(专利权)人：段学欣，何美杭，
类型：发明
国别省市：天津,12