The present invention relates to the general field of recombinant expression of polypeptides in animal cell cultures. More specifically, the present invention relates to cell selection improvements using recombinant engineered vectors designed to express polypeptides, in particular heteropolymer polypeptides.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用谷氨酰胺合成酶基因内互补载体直接选择表达高水平异聚蛋白的细胞相关申请的交叉引用本申请要求2016年5月11日提交的美国临时申请号62/334,966的权益,所述临时申请特此以引用的方式整体并入。以电子方式提交的文本文件的描述本申请含有已经以ASCII格式电子提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。创建于2017年5月8日的序列表的计算机可读格式拷贝名为A-2011-WO-PCT_SEQ_ST25.txt且大小为79.1千字节。
本专利技术涉及哺乳动物细胞培养物中的多肽的重组表达的一般领域。更具体地说,本专利技术涉及经设计以表达异聚多肽的重组工程化载体的细胞中的选择改进。专利技术背景异聚重组蛋白的表达通常需要组分链的类似表达,以避免不能并入至成熟蛋白中的链的不必要的合成。另外,大多数用于产生异聚重组蛋白的方法需要筛选许多克隆,以鉴别表达高水平的成熟异聚蛋白的每条链的相当高表达克隆。一种断裂选择性标记系统(在所述系统中选择性标记断裂成两个节段并且每个片段连接至异聚蛋白的一条链的表达)可用于鉴别表达两个选择性标记片段且因此表达异聚蛋白的两条链的那些细胞。谷氨酰胺合成酶(GS)通过氨与谷氨酸盐的缩合来催化谷氨酰胺生物合成。哺乳动物GS酶是由两个堆叠的五聚环组成的十聚体,其中十个活性位点定位在亚基的接点处。每个活性位点通过来自一个亚基的N-末端结构域(β-抓握结构域,其由残基25-112组成)的残基和通过来自相邻亚基的C-末端结构域(催化结构域,其由残基113-373组成)的残基来形成。酿酒酵母菌(S.cerevisiae)和大肠杆菌(E.coli)的遗传研 ...
【技术保护点】
1.一种载体,其包含:a)第一核酸,所述第一核酸编码第一多肽,以及b)第二核酸,所述第二核酸编码第二多肽,其中所述第二多肽是选择性标记的初始突变体亚基,其中所述第一核酸的转录可操作地连接至所述第二核酸的转录,所述载体还包含:c)第三核酸,所述第三核酸编码第三多肽,其中所述第三多肽能够与所述第一多肽缔合以形成异聚复合物,以及d)第四核酸,所述第四核酸编码第四多肽,其中所述第四多肽是所述选择性标记的互补突变体亚基,其中所述第三核酸的转录可操作地连接至所述第四核酸的转录,其中所述选择性标记的所述初始突变体亚基和所述互补突变体亚基相互作用以提供可选择活性,并且进一步其中所述载体能够转染到哺乳动物细胞中并改进转染的细胞的选择。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.11 US 62/3349661.一种载体,其包含:a)第一核酸,所述第一核酸编码第一多肽,以及b)第二核酸,所述第二核酸编码第二多肽,其中所述第二多肽是选择性标记的初始突变体亚基,其中所述第一核酸的转录可操作地连接至所述第二核酸的转录,所述载体还包含:c)第三核酸,所述第三核酸编码第三多肽,其中所述第三多肽能够与所述第一多肽缔合以形成异聚复合物,以及d)第四核酸,所述第四核酸编码第四多肽,其中所述第四多肽是所述选择性标记的互补突变体亚基,其中所述第三核酸的转录可操作地连接至所述第四核酸的转录,其中所述选择性标记的所述初始突变体亚基和所述互补突变体亚基相互作用以提供可选择活性,并且进一步其中所述载体能够转染到哺乳动物细胞中并改进转染的细胞的选择。2.如权利要求1所述的载体,其中所述异聚复合物是免疫球蛋白。3.如权利要求2所述的载体,其中所述第一核酸编码免疫球蛋白重链,并且所述第三核酸编码免疫球蛋白轻链。4.如权利要求1-3中任一项所述的载体,其中所述选择性标记是选自由以下组成的组的代谢酶:谷氨酰胺合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶、腺苷酸基琥珀酸合成酶以及谷氨酸脱氢酶。5.如权利要求1-4中任一项所述的载体,其中内部核糖体进入位点(IRES)发生在选自由以下组成的组的位点:a)在所述第一核酸与所述第二核酸之间的位点;b)在所述第三核酸与所述第四核酸之间的位点,以及c)在所述第一核酸与所述第二核酸之间、以及在所述第三核酸与所述第四核酸之间的位点。6.如权利要求5所述的载体,其中所述内部核糖体进入位点包含SEQIDNO:23。7.如权利要求1-6中任一项所述的载体,其中所述选择性标记的所述初始突变体亚基是谷氨酰胺合成酶的N-末端突变体(mutGS-NT),并且所述选择性标记的所述互补突变体亚基是谷氨酰胺合成酶的C-末端突变体(mutGS-CT)。8.如权利要求7所述的载体,其中所述mutGS-NT包含两个或更多个选自由以下组成的组的突变:W60AN61AD63AD63RS66A和D76A,并且所述mutGS-CT包含一个或多个选自由以下组成的组的突变:E134AE136AE196AE203AN248AH253AN255AR319A和R324A。9.如权利要求8所述的表达系统,其中所述mutGS-NT选自由以下组成的组:W60AN61AD63A(mutGS-NT1;SEQIDNO:6)、W60AN61AD63AS66A(mutGS-NT2;SEQIDNO:10)W60AN61AD63AS66AD76A(mutGS-NT3;SEQIDNO:25)和W60AN61AD63RS66A(mutGS-NT4;SEQIDNO:19);并且所述mutGS-CT选自由以下组成的组:E134AE136AE196AE203A(mutGS-CT1;SEQIDNO:21)和N248AH253AN255A(mutGS-CT2;SEQIDNO:22)。10.一种分离的宿主细胞,其用如权利要求1-9中任一项所述的载体转染、转化或转导。11.如权利要求10所述的宿主细胞,其选自由以下组成的组:CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系以及WI38细胞。12.一种产生异聚复合物的方法,所述方法包括在由所述宿主细胞表达所述异聚复合物的条件下培养如权利要求11所述的宿主细胞的步骤。13.如权利要求12所述的方法,其中所述异聚复合物是抗体。14.如权利要求13所述的方法,其还包括分离所述异聚复合物。15.一种表达系统,其包含:a)第一载体,所述第一载体编码双顺反子转录物,所述第一载体包含编码第一多肽的第一核酸,所述第一核酸可操作地连接至编码第二多肽的第二核酸,其中所述第二多肽是选择性标记的初始突变体亚基,以及b)第二载体,所述第二载体编码双顺反子转录物,所述第二载体包含编码第三多肽的第三核酸,所述第三核酸可操作地连接至编码第四多肽的第四核酸,其中所述第四多肽是所述选择性标记的互补突变体亚基,所述互补突变体亚基能够与所述选择性标记的所述初始突变体亚基缔合以提供可选择活性,进一步其中所述第三多肽能够与所述第一多肽缔合以形成异聚复合物;并且进一步其中所述表达系统能够转染到哺乳动物细胞中并改进所述细胞的选择。16.如权利要求15所述的表达系统,其中所述异聚复合物是免疫球蛋白。17.如权利要求16所述的表达系统,其中所述第一核酸编码免疫球蛋白重链,并且所述第三核酸编码免疫球蛋白轻链。18.如权利要求17所述的表达系统,其中所述选择性标记选自由以下组成的组:谷氨酰胺合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶、腺苷酸基琥珀酸合成酶和谷氨酸脱氢酶。19.如权利要求15-18中任一项所述的表达系统,其中内部核糖体进入位点(IRES)发生在选自由以下组成的组的位点:a)在所述第一核酸与所述第二核酸之间的位点;b)在所述第三核酸与所述第四核酸之间的位点,以及c)在所述第一核酸与所述第二核酸之间、以及在所述第三核酸与所述第四核酸之间的位点。20.如权利要求19所述的表达系统,其中所述内部核糖体进入位点包含SEQIDNO:23。21.如权利要求15至20中任一项所述的表达系统,其中所述选择性标记的所述初始突变体亚基是谷氨酰胺合成酶的N-末端突变体(mutGS-NT),并且所述选择性标记的所述互补突变体亚基是谷氨酰胺合成酶的C-末端突变体(mutGS-CT)。22.如权利要求21所述的表达系统,其中所述mutGS-NT包含两个或更多个选自由以下组成的组的突变:W60AN61AD63AD63RS66A和D76A,并且所述mutGS-CT包含一个或多个选自由以下组成的组的突变:E134AE136AE196AE203AN248AH253AN255AR319A和R324A。23.如权利要求22所述的表达系统,其中所述mutGS-NT选自由以下组成的组:W60AN61AD63A(mutGS-NT1;SEQIDNO:6)、W60AN61AD63AS66A(mutGS-NT2;SEQIDNO:10)W60AN61AD63AS66AD76A(mutGS-NT3;SEQIDNO:25)和W60AN61AD63RS66A(mutGS-NT4;SEQIDNO:19);并且所述mutGS-CT选自由以下组成的组:E134AE136AE196AE203A(mutGS-CT1;SEQIDNO:21)和N248AH253AN255A(mutGS-CT2;SEQIDNO:22)。24.一种分离的宿主细胞,其用如权利要求15-23中任一项所述的表达系统转染、转化或转导。25.如权利要求24所述的宿主细胞,其选自由以下组成的组:CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系以及WI38细胞。26.一种产生异聚复合物的方法,所述方法包括在由所述宿主细胞表达所述异聚复合物的条件下培养如权利要求25所述的宿主细胞的步骤。27.如权利要求26所述的方法,其还包括分离所述异聚复合物。28.一种表达系统,其包含:第一载体,所述第一载体包含编码抗体的重链的第一核酸,所述第一核酸可操作地连接至编码N-末端突变体谷氨酰胺合成酶(mutGS-NT)的第二核酸;以及第二载体,所述第二载体包含编码抗体的轻链的第三核酸,所述第三核酸可操作地连接至编码C-末端突变体谷氨酰胺合成酶(mutGS-CT)的第四核酸,其中谷氨酰胺合成酶的每个突变体亚基当单独表达时不具有可选择活性,并且所述mutGS-NT与所述mutGS-CT的共表达提供谷氨酰胺合成酶活性,其中所述表达系统能够转染到哺乳动物细胞中并改进转染的细胞的选择。29.如权利要求28所述的表达系统,其中所述mutGS-NT包含两个或更多个选自由以下组成的组的突变:W60AN61AD63AD63RS66A和D76A,并且所述mutGS-CT包含一个或多个选自由以下组成的组的突变:E134AE136AE196AE203AN248AH253AN255AR319A和R324A。30.如权利要求29所述的表达系统,其中所述mutGS-NT选自由以下组成的组:W60AN61AD63A(mutGS-NT1;SEQIDNO:6)、W60AN61AD63AS66A(mutGS-NT2;SEQIDNO:10)W60AN61AD63AS66AD76A(mutGS-NT3;SEQIDNO:25)和W60AN61AD63RS66A(mutGS-NT4;SEQIDNO:19);并且所述mutGS-CT选自由以下组成的组:E134AE136AE196AE203A(mutGS-CT1;SEQIDNO:21)和N248AH253AN255A(mutGS-CT2;SEQIDNO:22)。31.一种分离的宿主细胞,其用如权利要求28、29或30中任一项所述的表达系统转染、转化或转导。32.一种表达系统,其包含:第一载体,所述第一载体编码双顺反子转录物,所述第一载体包含编码所需多肽的第一核酸,所述第一核酸可操作地连接至编码选择性标记的初始突变体亚基的第二核酸;以及第二载体,所述第二载体编码双...
【专利技术属性】
技术研发人员:RR克彻姆,JT麦格鲁,DA富米纳亚林,TP蒙罗,NJ阿格拉沃尔,KM达里斯,
申请(专利权)人:美国安进公司,
类型:发明
国别省市:美国,US
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