一种快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片制造技术

本发明专利技术涉及快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片，可有效解决灵敏度低、重复性差、易受外界环境干扰，以及现有配套仪器昂贵、检测时间长的问题，底板为空心凹槽长方形，顶板置于底板凹槽的正上方，构成底板和顶板的密封结构，顶板的上平面有样品加样口和负压接口，底板的凹槽内经回形管装有串接在一起的样品加样区、血细胞过滤区、微栅反应腔、时间阀、识别反应区和废液池，血细胞过滤区上装有血细胞滤膜，样品加样口正对底板样品凹槽内的样品加样区，回形管的负压端接负压接口，微栅反应腔预封装有BNP检测抗体和质控抗体，构成样品与荧光标记的BNP单克隆抗体混合反应区；本发明专利技术结构简单，新颖独特，易生产制备，使用方便，准确率高，节能环保。

A Microfluidic Fluorescent Immunochip for Rapid Quantitative Detection of BNP

The invention relates to a microfluidic fluorescent immunochip for rapid quantitative detection of BNP, which can effectively solve the problems of low sensitivity, poor repeatability, susceptibility to external environment interference, and expensive and long detection time of existing supporting instruments. The bottom plate is a hollow groove rectangle, and the top plate is positioned directly above the bottom groove, thus forming a sealing structure of the bottom plate and the top plate, and the top plane of the top plate has a sample adding port. With negative pressure interface, the groove of the bottom plate is equipped with a sample adding area, a blood cell filtering area, a micro-grid reaction chamber, a time valve, a recognition reaction area and a waste liquid pool connected in series through a circular tube. The blood cell filtering area is equipped with a blood cell filter membrane. The sample adding port is positively opposite to the sample adding area in the groove of the bottom plate sample, the negative pressure interface is connected to the negative pressure end of the circular tube, and the micro-grid reaction chamber is pre-encapsulated with BNP. Detection of antibodies and quality control antibodies constitute a mixed reaction zone between samples and fluorescent labeled BNP monoclonal antibodies; the invention has simple structure, novel and unique features, easy production and preparation, convenient use, high accuracy, energy saving and environmental protection.

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片
本专利技术涉及医疗诊断设备，特别是一种快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片。
技术介绍
脑利尿钠肽(brainnatriureticpeptide，BNP)，又称B型利钠肽，具有32个氨基酸，分子量为4千道尔顿(4kDa)的氨基酸序列。当心室容积扩张和压力负荷增加时，心室肌细胞合成并分泌由108个氨基酸分子形成的BNP的前体，即前体BNP(Pro-BNP)，其后被水解成，形成无活性的带有氮末端的76个氨基酸(NT-proBNP)，和有活性的32-氨基酸，即BNP。BNP主要参与尿钠肽系统功能，包括调节血压和体液平衡(Bonow，R.O.，Circulation93:1946-1950，1996)。相关试验已经证实，人类的血清/血浆/全血中，可以检测到NT-pro-BNP，BNP，和BNP前体以及它们的一些混合片段(Tateyamaetah，Biochem.Biophys.Res.Commun.185:760-7,1992；Huntetah,Biochem.Biophys.Res.Commun.214:1175-83,1995)。含有108个氨基酸的pro-BNP序列如下。其中pro-BNP和BNP的第一位置的2个残基可以通过水解或蛋白水解去掉，从BNP的前体(pro-BNP)生成BNP3-108分子，从NT-pro-BNP生成BNP3-76分子，从BNP生成BNP79-108分子。心肌细胞分泌的pro-BNP，含有108个氨基酸的序列如下，下画线部分为有活性的BNP(BNP77-108)序列：HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGV50WKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPRSPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGL100GCKVLRRH108pro-BNP(BNP1-108)是由更大的前体pre-pro-BNP形成，该前体的序列如下(“前体”的特殊序列为粗体字母表示)：免疫检测和诊断相关疾病，可以通过构建并产生这些序列的特异性抗体，从而特异性结合上述不同BNP序列的多肽，继而确认并定量检测BNP的浓度。测定BNP的临床意义主要有：急性呼吸困难的鉴别诊断，心源性猝死预测，心力衰竭病人的危险分层及监测心力衰竭的治疗，同时，可以提示心力衰竭的预后。在2001年修订的欧洲心脏病学会(ESC)心衰诊疗指南中，已经把脑钠肽作为心衰诊断的工具。2005年欧洲和美国心衰诊疗指南，都进一步肯定了脑钠肽在心衰诊断中的作用，可以作为一个更好的预示心衰状况的指标。我国2007年《慢性心力衰竭诊断治疗指南》和2010年《急性性心力衰竭诊断治疗指南》也推荐将BNP用于心衰的诊断和预后判断。目前市场上测定血清/血浆/全血中的BNP方法，多用酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、电化学发光法、免疫比浊法、荧光免疫法及胶体金免疫层析法等。专利CN101819208A公开了一种测定血清中脑钠肽的试剂盒，该试剂盒采用了纳米微球免疫比浊法，通过加入纳米微球标记抗体等不同试剂，形成不溶性的抗原-抗体的复合物，产生浊度，从而实现了脑钠肽的高灵敏检测。专利CN204188626U公开了一种B型利钠肽免疫层析半定量检测试纸，该方法通过参比线的设置以及对划线抗体含量的精确控制，采用胶体金作为标记物，实现对BNP浓度的半定量检测。专利CN104569429A公开了一种快速定量检测脑钠肽的荧光免疫方法，该方法采用均相荧光免疫检测法，实现对抗原BNP的定量检测。CN105021829A公开了一种定量检测B型钠尿肽的ELISA试剂盒，该方法将纳米免疫磁珠分离技术与免疫荧光检测技术相结合，免疫磁珠和双抗体夹心荧光免疫法，对BNP进行了定量检测。但酶联免疫检测法操作复杂，检测耗时长；放射免疫分析法，核素污染；电化学发光法对专业技术要求高，虽具有准确、灵敏度高、特异性强等优点，但其所用仪器价格昂贵，不能快速提供检查结果。胶体金免疫层析法具有操作简便、检测快速，标本用量少，价格便宜的优势，但是当待测物质含量较低，通过肉眼来判断容易出现误判，灵敏度较低，同时，只能实现半定量的检测。荧光免疫层析法大多数采用荧光素或量子点等物质作为发光源，虽然有较高的线性范围，但受背景信号的干扰，本底值较高，不能够保证低端灵敏度，同时，重复性较低。微流控技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。微流控芯片，是微流控技术(Microfluidics)实现的主要平台，有着体积轻巧、使用样品及试剂量少，且反应速度快、可大量平行处理及可即用即弃等优点。随着芯片微加工技术的快速发展，微流控技术得到了广泛的应用。美国专利US005458852A介绍了一种微流控芯片，该芯片包括检测装置、检测系统和流量控制单元等设备组件，涵盖目标配体结合区域，实现了液体流动控制与时间控制、反应孵化、分离清洗和检测等步骤，实现了传统中免疫层析试纸条的所有功能。美国专利US20110243795Al公开了一种没有外部电源控制的微流控芯片，该芯片通过不同微结构区域，预处理环节、反应通道、清洗环节，来控制样品与缓冲液的加样时间差，保证了待测样品的重复性和稳定性。中国专利US771989B2阐述了一种基于特定控制阀控制液体流动的微流控芯片，该芯片采用免疫荧光检测法，通过不同功能区实现抗体包被、荧光抗体固定、抗原的检测与分析，应用于血清/血浆/尿液等样品中生物标志物的检测。中国专利CN105259162A公开了一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，实现对全血样品中BNP的定量检测，但由于结构上的问题，其使用并不尽人意。针对现有BNP检测设备的不足和缺陷，开发快速、准确、稳定性高、灵敏度高的BNP定量检测设备，具有巨大发展潜力和应用前景。微流控芯片技术能够实现样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成于一块微米尺度的芯片，同时，微通道形成的网络，能够贯穿整个系统，具有便携、低能耗、易于制作等优点，易于满足生命科学对生物样品进行低剂量、更高效、高灵敏、快速分离分析的需求，有望为即时诊断和家庭医疗等领域提供新的快速诊断设备。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片，可有效解决灵敏度低、重复性差、易受外界环境干扰，以及现有配套仪器昂贵、检测时间长的问题。本专利技术解决的技术方案是，一种快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片，包括底板、顶板、样品加样区、微栅反应腔、识别反应区、废液室和血细胞过滤区，所述的底板为空心凹槽长方形，顶板置于底板凹槽的正上方，构成底板和顶板的密封结构，顶板的上平面有样品加样口和负压接口，底板的凹槽内经回形管装有串接在一起的样品加样区、血细胞过滤区、微栅反应腔、时间阀、识别反应区和废液池，血细胞过滤区上装有血细胞滤膜，样品加样口正对底板样品凹槽内的样品加样区，回形管的负压端接负压本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片，包括底板、顶板、样品加样区、微栅反应腔、识别反应区、废液室和血细胞过滤区，其特征在于，所述的底板（1）为空心凹槽长方形，顶板（2）置于底板凹槽的正上方，构成底板和顶板的密封结构，顶板的上平面有样品加样口（11）和负压接口（9），底板的凹槽内经回形管（10）装有串接在一起的样品加样区（3）、血细胞过滤区（12）、微栅反应腔（5）、时间阀（6）、识别反应区（7）和废液池（8），血细胞过滤区（12）上装有血细胞滤膜（4），样品加样口（11）正对底板样品凹槽内的样品加样区（3），回形管（10）的负压端接负压接口（9），微栅反应腔（5）预封装有BNP检测抗体和质控抗体，构成样品与荧光标记的BNP单克隆抗体混合反应区；识别反应区（7）预封装BNP捕获抗体和质控抗体；样品加样区（3）中的样品靠自虹吸作用移动或采用负压接口连接控制泵进行移动；所述的BNP抗体的制备方法包括以下步骤：1）、荧光微球的活化、洗涤，将荧光微球表面修饰基团活化，取直径为200 nm荧光微球，加入缓冲液离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，使荧光微球的质量体积比终浓度为1%，所述洗涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种：2）、BNP抗体偶联荧光微球，取1 ml活化洗涤后的200 nm胶乳溶液，加入抗BNP抗体，使抗BNP抗体终浓度为1 mg/ml ；混匀后，置4度，摇床以220rpm转速包被8h；用PBS缓冲液洗涤未与荧光微球结合的抗BNP抗体，重复3次；封闭：将洗涤后的抗BNP抗体的荧光微球溶于包含所述保护剂的缓冲液中，使所述荧光微球的质量体积比终浓度为0.1‑0.14%；3）、抗BNP抗体和荧光微球结合后封闭，将所述荧光微球与所述抗BNP抗体混合物，加入BSA0.3%，室温下反应2 h，离心，除去其中少量的沉淀物；清洗，将形成的荧光微球‑抗BNP抗体复合物溶液离心，弃上清，加入磷酸盐缓冲液重复清洗3次；将末次沉淀溶于含所述保护剂和防腐剂的缓冲液中，使荧光微球质量体积比终浓度为0.04%‑0.14%。...

【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测BNP的微流控荧光免疫芯片，包括底板、顶板、样品加样区、微栅反应腔、识别反应区、废液室和血细胞过滤区，其特征在于，所述的底板（1）为空心凹槽长方形，顶板（2）置于底板凹槽的正上方，构成底板和顶板的密封结构，顶板的上平面有样品加样口（11）和负压接口（9），底板的凹槽内经回形管（10）装有串接在一起的样品加样区（3）、血细胞过滤区（12）、微栅反应腔（5）、时间阀（6）、识别反应区（7）和废液池（8），血细胞过滤区（12）上装有血细胞滤膜（4），样品加样口（11）正对底板样品凹槽内的样品加样区（3），回形管（10）的负压端接负压接口（9），微栅反应腔（5）预封装有BNP检测抗体和质控抗体，构成样品与荧光标记的BNP单克隆抗体混合反应区；识别反应区（7）预封装BNP捕获抗体和质控抗体；样品加样区（3）中的样品靠自虹吸作用移动或采用负压接口连接控制泵进行移动；所述的BNP抗体的制备方法包括以下步骤：1）、荧光微球的活化、洗涤，将荧光微球表面修饰基团活化，取直径为200nm荧光微球，加入缓冲液离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，使荧光微球的质量体积比终浓度为1%，所述洗涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种：2）、BNP抗体偶联荧光微球，取1ml活化洗涤后的200nm胶乳溶液，加入抗BNP抗体，使抗BNP抗体终浓度为1mg/ml；混匀后，置4度，摇床以220rpm转速包被8h；用PBS缓冲液洗涤未与荧光微球结合的抗BNP抗体，重复3次；封...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛亚静，付红伟，张娟丽，高勇，徐泼实，李海剑，李伟甲，刘亚品，马万顺，
申请(专利权)人：郑州亲和力科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41