一种翘嘴鳜TLR7基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种翘嘴鳜TLR7基因及其应用。本发明专利技术翘嘴鳜TLR7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该TLR7基因用于对翘嘴鳜病原感染初期的检测，具体为：根据翘嘴鳜体内TLR7‑Myd88依赖型抗病信号通路相关基因设计特异性扩增引物，其中，所述TLR7‑Myd88依赖型抗病信号通路相关基因包括TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7基因，在翘嘴鳜被感染病毒或细菌初期，采用qPCR检测方法对TLR7‑Myd88依赖型抗病信号通路相关基因mRNA表达量的显著应答反应进行检测和分析，将检测结果作为鱼体被病毒或细菌感染初期的辅助指标。本发明专利技术为翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的早期诊断提供新思路，有利于鱼类病害的早期防治，提高鳜鱼养殖经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种翘嘴鳜TLR7基因及其应用
本专利技术属于水产养殖、生物
，尤其涉及一种翘嘴鳜TLR7基因及其在对翘嘴鳜被病原感染初期时进行检测方面的应用。
技术介绍
翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)，属于鲈形目(Perciformes)、鳜亚科(Sinipercinae)、鳜属(Siniperca)，是我国的名贵经济鱼类和重要淡水养殖品种。然而随着近年来人工养殖规模的不断扩大，翘嘴鳜的种质退化、抗病能力下降等现象比较普遍，导致病毒性等疾病的曝发日益猖獗，而且至今未有十分有效的防治方法，每年都造成严重的经济损失，严重制约了其养殖业的可持续发展。因此，对于翘嘴鳜被病原感染的早期检测诊断是防治其病害曝发的重要手段。现有鱼类被感染病毒或细菌病原的检测诊断是根据鱼类的发病症状进行初步判断，然后解剖取病样组织提取病原，再将其提纯、鉴定后进行活体攻毒实验后验证是否是发病的病原，才能确诊鱼体是否感染了病毒或细菌等病原而引起发病症状；且由于可能是多种病原或未知病原引起的疾病，难以做出判断。不但耗时费力、操作困难，而且由于被感染病毒或细菌病原初期的鱼类无任何发病症状，因此现有的技术无法在鱼类被病毒或细菌病原感染初期对其做出正确的检测，错失了最佳病害防治时机，待到出现发病症状后再做出判断时，鱼类的免疫力已经降低，感染鱼类的病原已经增殖蔓延并引发了组织病变，此时鱼类病害防治的效果往往不理想。因此，专利技术一种鱼类病原感染早期检测的技术尤为重要。开展与抗病相关基因的cDNA全长序列克隆，在此基础上利用实时荧光定量PCR技术(qPCR)定性和定量检测抗病相关基因的mRNA表达量，根据被感染病毒或细菌病原初期的鱼类会激活体内抗病相关基因大量表达的原理，通过检测并分析抗病相关基因表达量的变化规律，可作为诊断鱼类被病原感染的早期辅助指标，可为鱼类病害的早期防治方案提供依据，是提高鱼类病害防治效果的有效手段。其中，qPCR技术是分析基因表达谱的一种常用的方法技术，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号在扩增反应中的循环累积实时监测整个PCR进程，最终通过特定数学原理对未知模板进行定量及定性分析，具有灵敏性高、特异性强、快速准确等特点，可以分析特定基因在不同时期或不同处理样本间的基因表达差异等，是一种强有力的检测基因表达的方法。在抗病相关基因中，TLRs(Toll样受体)是细胞表面的、病原模式识别受体分子(PRRs)，能特异性识别各种微生物(病原体)的相关分子模式(PAMP)，并激活多种抗病信号通路基因的表达，进而产生免疫防御功能。TLR7是TLRs中最重要的一类，主要位于细胞内的细胞器中，如内质网、前溶酶体、溶酶体和核内体中，在鱼类中负责识别病毒双链RNA(dsRNA)和革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，参与鱼类抗病毒和抗菌免疫反应，并通过接头蛋白Myd88介导下游的免疫反应。目前大西洋鲑、大黄鱼、牙鲆等鱼类TLR7基因的克隆和表达已有报道，但未见翘嘴鳜TLR7的克隆以及相关通路基因表达研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种翘嘴鳜TLR7基因，TLR7是TLR家族中最重要的成员之一，鱼类TLR7能识别病毒双链RNA(dsRNA)和G+细菌、G-细菌的受体并激活表达，参与鱼类抗病原免疫反应。克隆重要的经济鱼类翘嘴鳜TLR7基因，对于丰富鱼类TLR7基因库，进一步研究鱼类TLR系统的抗病分子机制及其应用具有重要价值。本专利技术的再一目的在于提供上述翘嘴鳜TLR7基因在对翘嘴鳜被病原感染初期时进行检测方面的应用，在本专利技术翘嘴鳜TLR7cDNA克隆的基础上，通过qPCR技术检测被病毒或细菌感染的翘嘴鳜体内TLR7以及TLR7-Myd88通路相关基因(Myd88、IRAK1和IRF7)的表达量，可初步诊断翘嘴鳜是否受到病毒或细菌感染，为鱼类病害的早期防治提供较为可靠的依据，进而增加鱼类养殖的经济效益。本专利技术是这样实现的，一种翘嘴鳜TLR7基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术进一步公开了一种翘嘴鳜TLR7蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术进一步公开了上述翘嘴鳜TLR7基因在翘嘴鳜病原感染初期检测中的应用。优选地，该应用具体包括以下步骤：(1)根据翘嘴鳜体内TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因设计特异性扩增引物，其中，所述TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因包括TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7基因；(2)在翘嘴鳜被感染病毒或细菌初期，采用qPCR检测方法对TLR7-Myd88依赖型抗病信号通路相关基因mRNA表达量的显著应答反应进行检测和分析，将检测结果作为鱼体被病毒或细菌感染初期的辅助指标。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术首次克隆了翘嘴鳜TLR7cDNA全长序列，丰富了鱼类TLR7基因库，对于进一步研究鱼类抗病分子机制及其应用具有重要价值，为鱼类的病害防治和抗病选育等工作提供研发基础；(2)本专利技术建立了翘嘴鳜TLR7-Myd88通路相关基因(TLR7、Myd88、IRAK1和IRF7)的qPCR检测技术，基于发现的翘嘴鳜被病毒或细菌感染的数小时至数天内体内TLR7基因及其信号通路基因表达量极显著(P<0.01)变化的规律，作为翘嘴鳜被病原早期感染的辅助诊断技术，为翘嘴鳜受到病毒或细菌感染的早期诊断提供新思路，有利于鱼类病害的早期防治，提高鳜鱼养殖经济效益。附图说明图1是翘嘴鳜TLR7基因各阶段扩增后的凝胶电泳结果；其中，图1-A是翘嘴鳜TLR7基因cDNA5’端RACE第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为目的片段；图1-B是翘嘴鳜TLR7基因cDNA3’端RACE第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为目的片段；图2是翘嘴鳜TLR7基因编码的氨基酸组成表；图3是翘嘴鳜TLR7基因编码的蛋白质结构域SMART预测；图4是病毒感染后的翘嘴鳜头肾中TLR7-Myd88依赖型通路相关基因的mRNA表达量变化，注：结果以means±SEM的形式显示；*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)，**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)；图5是细菌感染后的翘嘴鳜头肾中TLR7-Myd88依赖型通路相关基因的mRNA表达量变化，注：结果以means±SEM的形式显示；*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)，**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)；图6是细菌感染后在翘嘴鳜脾脏组织中TLR7-Myd88依赖型通路相关基因的mRNA表达量变化，注：结果以means±SEM的形式显示；*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)，**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1一、翘嘴鳜TLR7cDNA的克隆TLR7基因cDNA扩增所用引物，如下表1所示：表1TLR7基因cDNA扩增所用引物的序列引物名称引物序列(5’-3’)目的GSP-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种翘嘴鳜TLR7基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种翘嘴鳜TLR7基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种翘嘴鳜TLR7蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.权利要求1所述的翘嘴鳜TLR7基因在翘嘴鳜病原感染初期检测中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用具体包括以下步骤：(1)根据翘嘴鳜体内TLR7-Myd88依赖...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹤忠，路瑶，叶金明，肖攀，李泽，金锐铭，董同瑚，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32