方法技术

技术编号:20083350 阅读:74 留言:0更新日期:2019-01-15 03:28
本发明专利技术涉及一种使用孔表征靶多核苷酸的新方法。所述方法涉及在所述多核苷酸已经移动通过所述孔后控制通过所述靶多核苷酸形成二级结构。

Method

The invention relates to a new method for characterizing target polynucleotides by using pore. The method involves controlling the formation of a secondary structure through the target polynucleotide after the polynucleotide has been moved through the pore.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】方法
本专利技术涉及使用孔表征靶多核苷酸的方法。
技术介绍
当前在广泛的应用范围内需要快速且便宜的核酸(例如,DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵,主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量多核苷酸并且需要大量用于信号检测的专用荧光化学品。跨膜孔(纳米孔)作为聚合物和各种小分子的直接电子生物传感器具有巨大的潜力。具体地,最近关注作为潜在的DNA测序技术的纳米孔。当跨纳米孔施加电势时,当如核苷酸等分析物在桶中暂时停留一段时间时,电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸给出已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中,使单个多核苷酸链通过孔并且衍生出核苷酸的同一性。链测序可以涉及使用分子刹车来控制移动所述多核苷酸通过孔。
技术实现思路
诸位专利技术人惊奇地证明,在多核苷酸已经移动通过跨膜孔后,可以通过控制通过多核苷酸形成二级结构来改善靶多核苷酸的表征。因此,提供了一种表征靶多核苷酸的方法,其包括:(a)使所述靶多核苷酸与膜中跨膜孔的一侧以及控制所述靶多核苷酸移动通过孔的分子刹车接触;以及(b)当所述多核苷酸相对于所述孔移动时,进行一次或多次指示所述靶多核苷酸的一个或多个特性的测量;其中选择所述孔的另一侧上的条件来控制通过所述孔的另一侧上的所述靶多核苷酸形成二级结构。还提供了一种表征双链靶多核苷酸的方法,其包括:(a)提供包括所述靶多核苷酸的构建体,其中所述靶多核苷酸的所述两条链通过发夹环连接在所述靶多核苷酸的一端处;(b)使所述构建体与膜中跨膜孔的一侧以及分子刹车接触,所述分子刹车分离所述构建体的所述两条链并且控制所述构建体通过所述孔一次移动一条链;以及(c)当所述构建体相对于所述孔移动时,进行一次或多次指示所述靶多核苷酸的一个或多个特性的测量;其中所述发夹环被设计成控制所述靶多核苷酸的所述两条链在所述孔的另一侧上再杂交的能力。控制所述靶多核苷酸的所述两条链再杂交的能力可以控制再杂交的多核苷酸的形成的程度和/或一致性(例如,通过所述孔再杂交的多核苷酸的比例和杂交的再现性,例如,依据其发生的速度、结合的强度而言)。进一步提供了:-一种用于表征双链靶多核苷酸的试剂盒,其包括(a)能够在一端处连接所述靶多核苷酸的所述两条链的发夹环和(b)控制或减少通过所述靶多核苷酸形成二级结构的一种或多种物种;以及-一种用于对靶多核苷酸进行测序的设备,其包括:(a)多个膜;(b)所述膜中的多个跨膜孔;以及(c)在所述孔的另一侧上的条件,所述孔与所述多核苷酸在所述孔的另一侧接触,所述条件能够控制通过所述靶多核苷酸形成二级结构。附图说明图1示出了构建体1的示意图,其中A是解旋酶(T4Dda1993-(E94C/A360C)(具有突变E94C/A360C的SEQIDNO:24并且然后(ΔM1)G1G2(其中(ΔM1)G1G2=M1缺失并且然后添加G1和G2))结合在DNA序列1(B)的指定区上,所述DNA序列1(B)与DNA序列2(D)和DNA序列3(E)杂交。DNA序列1还用连接的发夹、DNA序列4(C)附接到DNA序列2上。图2示出了当解旋酶(T4Dda1993-(E94C/A360C))控制DNA构建体1通过MspA纳米孔易位时的示例电流迹线(y轴标记=电流(pA),x轴标记=时间(秒))。下图是上图的放大版本。标记为A的区对应于模板(DNA序列1)。标记为B的区对应于补体(DNA序列2)。标记为C的区对应于发夹(DNA序列4)。在此图中,模板和补体具有相似的电流范围,具有相似的持续时间并且具有相似的速度。这是表现出无隆起的解旋酶控制的DNA移动的实例。图3示出了当解旋酶(T4Dda1993-(E94C/A360C))控制DNA构建体1通过MspA纳米孔易位时的示例电流迹线(y轴标记=电流(pA),x轴标记=时间(秒))。下图是上图的放大版本。标记为A的区对应于模板(DNA序列1)。标记为B的区对应于补体(DNA序列2)。标记为C的区对应于发夹(DNA序列4)。在此图中,补体具有比模板更高的电流范围,持续时间更短并且速度更快。这是表现出隆起的解旋酶控制的DNA移动的实例。图4示出了当解旋酶(T4Dda1993-(E94C/A360C))控制DNA构建体1通过MspA纳米孔易位时的示例电流迹线(y轴标记=电流(pA),x轴标记=时间(秒))。下图是上图的放大版本。标记为A的区对应于模板(DNA序列1)。标记为B1和B2的区对应于补体(DNA序列2)。标记为C的区对应于发夹(DNA序列4)。在此图中,补体最初具有与模板(B1)类似的电流范围和速度,并且然后改变到当前范围高于模板的行为,速度更快并且持续时间更短。这是表现出延迟隆起的解旋酶控制的DNA移动的实例。图5示出了当解旋酶(T4Dda1993-(E94C/A360C))通过具有存在于膜反式侧的单链DNA(AE182)的MspA纳米孔控制DNA构建体1顺式到反式易位时的示例电流迹线(y轴标记=电流(pA),x轴标记=时间(秒))。下图是上图的放大版本。标记为A的区对应于模板(DNA序列1)。标记为B1和B2的区对应于补体(DNA序列2)。标记为C的区对应于发夹(DNA序列4)。在此图中,补体最初具有比模板(B1)高的电流范围和速度,并且然后更改为当前范围和速度类似于模板(B2)的行为,然后返回到初始行为(B1))。设计AE182链以与构建体1的模板区中间的区杂交。此数据示出了AE182控制其杂交的构建体1的区中形成二级结构。图6示出了通过观察解旋酶(T4Dda1993-(E94C/A360C))通过MspA纳米孔控制DNA构建体1易位获得的数据,并且将所述解旋酶控制的DNA移动分为以下三类之一:隆起、无隆起或延迟隆起。反式DNA列(第1列)和浓度列(第2列)示出了除缓冲液1外还存在于反式室中(与添加靶多核苷酸相反的纳米孔的一侧)。图7示出了图6中的作为条形图的数据。x轴上的数字对应于数据表的行号(图6)。y轴上的数字对应于观察到的解旋酶控制移动的百分比。黑色条的高度表示已经被归类为“无隆起”而不是“隆起”或“延迟隆起”的易位的百分比。对照条件(没有添加到反式侧以控制二级结构的多核苷酸序列)显示在第13行中并且用箭头标记。图8示出了当解旋酶(T4Dda1993-(E94C/A360C))控制DNA构建体1通过MspA纳米孔易位时的示例电流迹线(y轴标记=电流(pA),x轴标记=时间(秒))。较低的图片放大了顶部图片的版本。标记为A的区对应于模板(DNA序列1)。标记为B1和B2的区对应于补体(DNA序列2)。标记为C的区对应于发夹(DNA序列4)。在此图中,补体最初具有比模板(B1)高的电流范围和速度,并且然后更改为当前范围和速度类似于模板的行为。此示例迹线示出了盐活性核酸酶(SAN)沿着模板区切割构建体1部分。因此,在标记为B1但未在标记为B2的区中观察到隆起,因为当区B2易位通过纳米孔时,与补体杂交的模板区已经被SAN切断。图9示出了具有模板区、补体区和预结合酶的双链多核苷酸。解旋酶控制多核苷酸通过纳米孔的移动。一旦发夹(其连接模板和补体区)易位通过纳米孔,则DNA开始在纳米孔的反式侧上再杂交。再杂交被认为导致在解旋酶控制的DNA移动下在补体区中观察到隆起。图10示出了许本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表征靶多核苷酸的方法,其包括:(a)使所述靶多核苷酸与膜中跨膜孔的一侧以及控制所述靶多核苷酸移动通过所述孔的分子刹车接触;以及(b)当所述多核苷酸相对于所述孔移动时,进行一次或多次指示所述靶多核苷酸的一个或多个特性的测量;其中所述孔的另一侧上的条件控制通过所述孔的另一侧上的所述靶多核苷酸形成二级结构。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.25 GB 1609241.3;2016.05.27 GB 1609436.91.一种表征靶多核苷酸的方法,其包括:(a)使所述靶多核苷酸与膜中跨膜孔的一侧以及控制所述靶多核苷酸移动通过所述孔的分子刹车接触;以及(b)当所述多核苷酸相对于所述孔移动时,进行一次或多次指示所述靶多核苷酸的一个或多个特性的测量;其中所述孔的另一侧上的条件控制通过所述孔的另一侧上的所述靶多核苷酸形成二级结构。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述孔的另一侧上的所述条件减少了通过所述孔的另一侧上的所述靶多核苷酸形成二级结构。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述条件控制或减少通过所述孔的另一侧上的所述靶多核苷酸形成随机二级结构。4.根据权利要求3所述的方法,其中所述随机二级结构包括(a)一个或多个螺旋,(b)一个或多个环,(c)一个或多个假结,(d)一个或多个四链体或(e)其组合。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶多核苷酸是双链的,并且所述方法包括:(a)提供包括所述靶多核苷酸的构建体,其中所述靶多核苷酸的所述两条链通过发夹环连接在所述靶多核苷酸的一端处;(b)使所述构建体与膜中跨膜孔的一侧以及分子刹车接触,所述分子刹车分离所述构建体的两条链并且控制所述构建体通过所述孔一次移动一条链;以及(c)当所述构建体相对于所述孔移动时,进行一次或多次指示所述靶多核苷酸的一个或多个特性的测量;其中所述孔的另一侧上的所述条件控制通过所述孔的另一侧上的所述靶多核苷酸形成二级结构。6.根据权利要求5所述的方法,其中所述条件控制或降低所述靶多核苷酸的所述两条链在所述孔的另一侧上再杂交的能力或防止所述靶多核苷酸的所述两条链在所述孔的另一侧上再杂交。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述条件包括在所述孔的另一侧上的一种或多种物种,所述一种或多种物种控制或减少通过所述靶多核苷酸形成二级结构。8.根据权利要求7所述的方法,其中所述一种或多种物种包括(i)与所述靶多核苷酸和/或所述发夹环杂交的一种或多种对照多核苷酸,(ii)与所述靶多核苷酸和/或所述发夹环结合的一种或多种蛋白质或化学品,(iii)核酸酶或(iv)(i)、(ii)和(iii)的组合。9.根据权利要求8所述的方法,其中:(a)所述一种或多种对照多核苷酸包括通用核苷酸;(b)所述一种或多种对照多核苷酸包括假互补核苷酸(c)所述一种或多种对照多核苷酸与所述靶多核苷酸和/或所述发夹环互补;(d)所述一种或多种蛋白质是一种或多种单链结合蛋白(SSB)或衍生自解旋酶;(e)所述一种或多种化学品是一种或多种环糊精;或者(f)所述核酸酶是核酸内切酶、核酸外切酶或尿嘧啶特异性切割试剂(USER)。10.根据权利要求8或9所述的方法,其中所述条件包括(i)与所述靶多核苷酸和/或所述发夹环杂交的多个对照多核苷酸,(ii)与所述靶多核苷酸和/或所述发夹环结合的多种蛋白质或化学品或(iv)其组合。11.根据权利要求8到10中任一项所述的方法,其中所述一种或多种对照多核苷酸的长度为至少30个、至少60个或至少90个核苷酸。12.根据权利要求8到11中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员:理查德·亚历山大·古铁雷斯安德鲁·约翰·赫伦詹姆斯·怀特
申请(专利权)人:牛津纳米孔技术公司
类型:发明
国别省市:英国,GB

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