纳米化RNAi制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种纳米化RNAi制剂及其制备方法和应用，纳米化RNAi制剂包括壳聚糖和TMV dsRNA，TMV dsRNA吸附在壳聚糖表面，dsRNA的靶标基因为TMV外壳蛋白CP基因。纳米化RNAi制剂制备方法包括：抽提基因组RNA、设计引物、RT‑PCR扩增、dsRNA合成、dsRNA与壳聚糖结合得到纳米化RNAi制剂。本发明专利技术的RNAi制剂具有持效时间长、环境友好型、对作物无药害等优点，可应用于预防和治疗TMV。

Nano-RNAi preparation and its preparation method and Application

The invention discloses a nano-RNAi preparation and its preparation method and application. The nano-RNAi preparation includes chitosan and TMV dsRNA. TMV dsRNA is adsorbed on the surface of chitosan, and the target gene of dsRNA is TMV coat protein CP gene. The preparation methods of nano-RNAi preparation include: genomic RNA extraction, primer design, RT -PCR amplification, dsRNA synthesis, and the combination of dsRNA and chitosan to obtain nano-RNAi preparation. The RNAi preparation of the invention has the advantages of long holding time, environment-friendly and no harm to crops, and can be applied to prevent and treat TMV.

【技术实现步骤摘要】
纳米化RNAi制剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种纳米化RNAi制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
壳聚糖（chitosan，CS）又称脱乙酰甲壳素，是由广泛存在于自然界的几丁质(chitin)经化学处理脱乙酰作用得到。1859年，来自法国的Rouget首次分离获得壳聚糖后，因其天然高分子具有良好的安全性、生物相容性和微生物降解性等优良性能被广泛研究和应用于植物保护、生物治疗、基因工程、食品和医药等领域。壳聚糖分子中存在带正电荷葡糖胺基，因此可与负电荷的DNA、dsRNA等产生静电作用，二者经混合凝聚为的多聚复合物，使得DNA与CS结合形成结构较为致密的纳米级粒。研究表明，将CS与dsRNA进行结合，CS包裹住dsRNA获得的纳米微粒可以防止埃及伊蚊饲料琼脂块中的dsRNA游离，使得dsRNA更为稳定且可以有效传送至蚊虫体内。RNAi（RNAinterference）现象在生物中普遍存在，是一种由小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）介导在转录后产生基因沉默的现象，具有特异性、高效性、可传播性、竞争效应和位置效应等特点，在调控基因表达、抵御病毒入侵和防止基因组中逆转座元件扩增等方面均起到重要作用。RNAi技术在植物中的表现是将病毒的病原dsRNA转入植株的叶片或叶脉等部位，使得病原dsRNA与其同源mRNA发生基因沉默，使其降解的过程。随着对RNA干扰技术及其相关机制的不断研究，运用RNA干扰技术的特点为高效性、特异性和可传播性地治疗植物病毒病已有了一定的研究和应用，且运用RNAi为治疗植物病毒的提供了一个新途径。目前应用dsRNA抵抗病毒的稳定性与系统性欠佳，增强dsRNA的稳定性能使得RNAi更为稳定且可以提高治疗病毒病效果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种纳米化RNAi制剂，该纳米化RNAi制剂稳定性提高，对环境友好，其制备方法简单，可应用于对TMV的预防和治疗。一种纳米化RNAi制剂，所述纳米化RNAi制剂包括壳聚糖和dsRNA，所述dsRNA吸附在所述壳聚糖表面；所述dsRNA的靶标基因为TMV外壳蛋白CP基因。上述的纳米化RNAi制剂，优选的，所述壳聚糖和dsRNA的质量比为1︰4~10。进一步的，所述壳聚糖和dsRNA的质量比为1︰4。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的纳米化RNAi制剂的制备方法，包括以下步骤：S1、以TMVRNA为；根据所述TMVRNA设计含有HindIII和KpnI的扩增引物，进行RT-PCR扩增得到扩增产物；S2、将所述扩增产物连接转化至感受态细胞中，得到重组子；S3、以所述重组子作为模板，设计含有T7启动子序列的引物，进行PCR扩增，得到含有T7启动子的扩增产物；S4、将含有T7启动子的扩增产物作为模板，进行dsRNA的体外合成；S5、将合成的所述dsRNA与壳聚糖进行结合即得到纳米化RNAi制剂。上述的制备方法，优选的，所述S1步骤中所述含有HindIII和KpnI的扩增引物为SEQIDNO.2所示的DNA序列和SEQIDNO.3所示的DNA序列。上述的制备方法，优选的，所述S2步骤具体为：将所述扩增产物连接至pEASY-T1载体上得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞中得到重组子。上述的制备方法，优选的，所述S3步骤中所述含有T7启动子序列的引物为SEQIDNO.4所示的DNA序列和SEQIDNO.5所示的DNA序列。上述的制备方法，优选的，所述S5步骤具体为：S5-1、将所述壳聚糖溶于NaAc缓冲液中制备0.02w/v%壳聚糖工作液；S5-2、将所述dsRNA悬浮于Na2SO4液中得到dsRNA悬浮液；S5-3、将所述0.02w/v%壳聚糖工作液和所述dsRNA悬浮液振荡混合，使所述dsRNA吸附在壳聚糖的表面得到纳米化RNAi制剂。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的纳米化RNAi制剂在预防和治疗TMV上的应用。上述的应用，优选的，所述应用方法为：在烟草为5叶期时，将纳米化RNAi制剂喷施烟叶上。上述的应用，优选的，所述纳米化RNAi制剂的浓度为1v/v%。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：（1）本专利技术提供了一种纳米化RNAi制剂，纳米材料为壳聚糖；dsRNA的靶标基因为TMV外壳蛋白CP基因；采用体外合成dsRNA，结合纳米材料-壳聚糖，提高dsRNA的稳定性，形成纳米化RNAi制剂，使得dsRNA更好的作用于植物。（2）本专利技术提供了一种纳米化RNAi制剂的制备方法，工艺简单，对环境友好。（3）本专利技术提供了一种纳米化RNAi制剂在预防和治疗TMV上的应用，纳米化RNAi制剂对于TMV的预防和治疗效果分别为57.79%和58.4%，效果良好。附图说明为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为体外合成dsRNA电泳图。图2为壳聚糖结合dsRNA最佳比例筛选图。图中，M：Trans2KPlusIIDNAMarker；1：dsRNA；2：0.02%CS纳米材料工作液；3：CS与dsRNA融合比例1︰1；4：CS与dsRNA融合比例1︰2；5：CS与dsRNA融合比例1︰3；6：CS与dsRNA融合比例1︰4；7：CS与dsRNA融合比例1︰5；8：CS与dsRNA融合比例1︰10。图3为4℃条件下，壳聚糖结合dsRNA稳定性试验图。A：分别以dsRNA、CS-dsRNA初始溶液中dsRNA的量（100%）作为对照，测定其在4℃下30d内dsRNA量的变化图。B为琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：Trans2KPlusIIDNAMarker；1-4：dsRNA在4℃下0、10、20和30d稳定性结果；5-8：CS-dsRNA在4℃下0、10、20和30d稳定性结果。图4为25℃条件下，壳聚糖结合dsRNA稳定性试验图。A：分别以dsRNA、CS-dsRNA初始溶液中dsRNA的量（100%）作为对照，测定其在25℃下30d内dsRNA量的变化图。B为琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：Trans2KPlusIIDNAMarker；1-4：dsRNA在25℃下0、10、20和30d稳定性结果；5-8：CS-dsRNA在25℃下0、10、20和30d稳定性结果。图5为37℃条件下，壳聚糖结合dsRNA稳定性试验图。A：分别以dsRNA、CS-dsRNA初始溶液中dsRNA的量（100%）作为对照，测定其在37℃下30d内dsRNA量的变化图。B为琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：Trans2KPlusIIDNAMarker；1-4：dsRNA在37℃下0、10、20和30d稳定性结果；5-8：CS-dsRNA在37℃下0、10、20和30d稳定性结果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本专利技术作进一步描述，但并不因此而限制本专利技术的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。实施例1：一种本专利技术的壳聚糖结合TMVdsRNA纳米化RNAi制剂的制备，其制备方法包括以下步骤：（1）烟草花叶病毒RNA的提取：将感染TMV是三生烟叶片采集后，采用Tri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米化RNAi制剂，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂包括壳聚糖和dsRNA，所述dsRNA吸附在所述壳聚糖表面；所述dsRNA的靶标基因为TMV外壳蛋白CP基因。

【技术特征摘要】
1.一种纳米化RNAi制剂，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂包括壳聚糖和dsRNA，所述dsRNA吸附在所述壳聚糖表面；所述dsRNA的靶标基因为TMV外壳蛋白CP基因。2.根据权利要求1所述的纳米化RNAi制剂，其特征在于，所述壳聚糖和dsRNA的质量比为1︰4~10。3.一种权利要求1或2所述的纳米化RNAi制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、以TMVRNA为模板，根据所述TMVRNA设计含有HindIII和KpnI的扩增引物，进行RT-PCR扩增得到扩增产物；S2、将所述扩增产物连接转化至感受态细胞中，得到重组子；S3、以所述重组子为模板，设计含有T7启动子序列的引物，进行PCR扩增，得到含有T7启动子的扩增产物；S4、将所述含有T7启动子的扩增产物作为模板，进行dsRNA的体外合成；S5、将合成的所述dsRNA与壳聚糖进行结合即得到纳米化RNAi制剂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中所述含有HindIII和KpnI的扩增引物为SEQIDNO.2所示的DNA序列和SEQIDNO.3所示的DNA序...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙书娥，张德咏，刘勇，张松柏，谭新球，彭静，张卓，燕飞，李凡，陶小荣，何自福，缪武，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43