斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记引物及遗传性别鉴定方法技术

本发明专利技术公开了斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记引物及遗传性别鉴定方法。本发明专利技术根据获得的斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记引物及雄性特异等位基因序列，创建了斑点叉尾鮰遗传性别的PCR鉴定方法。本发明专利技术首次筛选到斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记及雄性特异等位基因，建立了斑点叉尾鮰遗传性别鉴定的PCR技术。本发明专利技术具有高效、准确和稳定的特点，在斑点叉尾鮰性别控制和单性苗种生产中具有重要应用价值，同时在克隆斑点叉尾鮰性别决定基因及性别分化机制研究中也具有重要应用前景。

Sex-Linked Microsatellite Marker Primers and Gender Identification of Catfish Spotted

The invention discloses microsatellite marker primers linked by sex of Catfish Spotted and a genetic sex identification method. According to the obtained sex-linked microsatellite marker primers and male-specific allele sequences, the method for identifying genetic sex of spotted catfish by PCR is established. For the first time, the microsatellite markers and male-specific alleles linked to the sex of the spotted catfish were screened, and the PCR technology for genetic sex identification of the spotted catfish was established. The invention has the characteristics of high efficiency, accuracy and stability, and has important application value in sex control and parthenogenetic seedling production of spotted catfish, and also has important application prospect in cloning sex determination gene of spotted catfish and Research on sex differentiation mechanism.

【技术实现步骤摘要】
斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记引物及遗传性别鉴定方法
本专利技术属于鱼类遗传育种的分子标记
，具体涉及一种利用荧光标记微卫星引物鉴定斑点叉尾鮰遗传性别的方法。
技术介绍
斑点叉尾鮰原产于美国，是一种世界性水产经济物种，1984年引入我国。因其具有肉质细嫩，营养丰富，出肉率高，没有肌间刺等优点，深受广大消费者欢迎。斑点叉尾鮰染色体核型研究表明二倍体染色体数目为58，2n＝58。采用AFLP、STR、SNP等多种分子标记构建的斑点叉尾鮰连锁图谱，并结合染色体带型分析以及全基因组关联分析结果，表明斑点叉尾鮰由28对常染色体和1对性染色体(分别为X和Y染色体)组成，属于XY/XX性别决定系统，雄性异配，雌性同配。斑点叉尾鮰雄性与雌性生长呈现明显的二态性，即雄性个体生长速度与成熟体质量均明显高于雌性个体。因此，积极开展斑点叉尾鮰性别连锁的分子标记研究，发掘与性别连锁的分子标记，将对斑点叉尾鮰性别控制机制研究，育种群体性别比例控制，以及全雄苗种培育等具有重要的理论意义与应用价值。微卫星标记是由1-6个碱基组成的短串联重复序列，具有多态性高、稳定性强、特异性高，并呈现共显性遗传的特点。因其符合孟德尔遗传分离规律，能够精确地区分纯合子和杂合子。以微卫星分型为基础的遗传性别鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。在多种鱼类性逆转研究过程中，利用性连锁微卫星标记准确地鉴定出遗传性别为雄性的雌性个体。因此，开发出一套基于微卫星分子标记的快速、准确鉴定斑点叉尾鮰遗传性别的方法，对斑点叉尾鮰育种工作的开展和性别决定机制的研究具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种斑点叉尾鮰雄性特异的等位基因。本专利技术的另一目的是提供一种斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记引物。本专利技术的又一目的是提供一种斑点叉尾鮰微卫星遗传性别鉴定方法，为斑点叉尾鮰性别决定机制研究、全雄苗种培育提供基础。主要是通过斑点叉尾鮰性别连锁微卫星标记位点进行PCR扩增和毛细管电泳分型检测来实现。本专利技术专利所采取的技术方案：一种斑点叉尾鮰雄性特异的等位基因,如SEQIDNO.27所示。本专利技术所述的等位基因作为检测靶点在斑点叉尾鮰遗传性别鉴定中的应用。所述的应用，优选利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示特异引物扩增斑点叉尾鮰基因组DNA，能够扩增出SEQIDNO.27所示斑点叉尾鮰雄性特异的等位基因的个体为雄性个体。一种斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记引物，由2条特异引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2组成，其中SEQIDNO.1的5’端经FAM荧光基团标记。本专利技术所述的微卫星标记引物在斑点叉尾鮰遗传性别鉴定中的应用。一种斑点叉尾鮰遗传性别鉴定的方法，提取待测遗传性别的斑点叉尾鮰基因组DNA，用经FAM荧光基团标记的引物SEQIDNO.1和正常引物SEQIDNO.2对斑点叉尾鮰基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物在ABI3730XL遗传分析系统上进行毛细管电泳，LIZ-500作为内参，用GeneMarkerv2.2.0软件读取扩增产物基因型；毛细管电泳图谱上具有大小为186bp的DNA片段的个体是遗传性别为雄性的斑点叉尾鮰，而无此等位基因C的个体的遗传性别为雌性。有益效果：首次筛选到了斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记，发现了雄性特异的等位基因，建立了基于微卫星标记技术的遗传性别鉴定方法。本专利技术具有高效、准确和稳定的特点，在斑点叉尾鮰性别控制，苗种培育早期性别鉴定以及全雄苗种生产中具有重要应用价值。附图说明图1为斑点叉尾鮰微卫星位点JSCC09128基因组定位及不同等位基因碱基序列。图2为斑点叉尾鮰微卫星位点JSCC09128基因分型结果。A：AC型，B：BC型，A和B为雄性个体基因分型结果；C：AA型，D：AB型，E：BB型，C、D和E为雌性个体基因分型结果。具体实施方式实施例1下面通过实施例，并结合附图对本专利技术
技术实现思路
进行详细叙述本专利技术包括三个方面：(1)斑点叉尾鮰性别连锁微卫星标记的筛选及其引物序列；(2)斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记的验证；(3)基于微卫星标记的斑点叉尾鮰遗传性别鉴定的应用方法。1.斑点叉尾鮰性别连锁微卫星标记的筛选及其引物序列1.1.性别连锁微卫星的筛选采集斑点叉尾鮰全同胞家系156尾个体及父母本DNA样品，共构建19个文库，测序数据为147Gb，父母本测序数据为3Gb，覆盖基因组约为3×，子代测序每个样本的平均数据量为900Mb，覆盖基因组为1×。利用初步筛选到的10661个SNP进行分群和遗传连锁图谱构建，LOD>10，分出29个连锁群。最终用于构建遗传连锁图谱的标记数为5017个，遗传距离长度为3147.3cM，平均长度为0.63cM。筛选高质量微卫星标记进行性连锁分析，共获得13个潜在性连锁微卫星标记定位到斑点叉尾鮰第17连锁群。1.2.微卫星引物的设计将获得的13个微卫星标记准确定位到其基因组所在位置。用primer3在线引物设计软件针微卫星标记的侧翼序列设计引物，引物合成委托上海生工生物进行。表1斑点叉尾鮰性别连锁微卫星位点及引物信息注：F为正向引物R为反向引物2.性别连锁的微卫星标记的验证2.1.基因组DNA提取分别选取已知性别的斑点叉尾鮰雄性和雌性个体各16尾，剪取每尾斑点叉尾鮰尾鳍样品约25mg，用液氮研磨成粉末，转移到1.5ml离心管中。先后加入450μLSTEDNA抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0)、35μLSDS(10％)，最后加入15μL蛋白酶K(0.2％)颠倒混匀。加入RnaseA1μL，置于水浴锅55℃温浴1h。加入等体积(约700μL)Tris饱和酚，在DNA混合仪上振荡混匀，4℃下12000rpm离心10min，结束后使用移液枪将上清液转移入另一个干净的离心管中。在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25:24:1)，置于DNA混合仪上振荡混匀15min。在上清液中加入等体积氯仿约500μL，置于DNA混合仪上振荡混匀15min。在上清液中加入—20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，离心机12000rpm离心5min后弃上清液。先加入70％乙醇洗涤两次，再加入无水乙醇洗涤一次，干燥后加入200μLTE，溶解充分。用NanoDropND-1000分光光度仪检测浓度，并将各DNA样品稀释成100ng/μL的工作液。2.2.PCR扩增每对微卫星引物分别对16尾雄性和雌性样品进行PCR扩增。PCR扩增使用2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，反应体系为：扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃～51℃(每个循环减1℃)退火30s，72℃延伸60s，每个退火温度2个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；72℃延伸10min。2.3.聚丙烯酰胺凝胶电泳上述PCR扩增产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，银染显带。银染步骤如下：①固定，粘有凝胶的玻璃板浸泡在乙酸水溶液中约10min；②漂洗，把玻璃板转入双蒸水中漂洗掉乙酸；③染色，在染色液(0.2％AgNO3100mL,加37％甲醛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑点叉尾鮰雄性特异的等位基因,其特征在于如SEQ ID NO.27所示。

【技术特征摘要】
1.一种斑点叉尾鮰雄性特异的等位基因,其特征在于如SEQIDNO.27所示。2.权利要求1所述的等位基因作为检测靶点在斑点叉尾鮰遗传性别鉴定中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示特异引物扩增斑点叉尾鮰基因组DNA，能够扩增出SEQIDNO.27所示斑点叉尾鮰雄性特异的等位基因的个体为雄性个体。4.一种斑点叉尾鮰性别连锁的微卫星标记引物，其特征在于由2条特异引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2组成，其中SEQIDNO.1的5’端经FAM荧光基团标记。5.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世勇，陈校辉，边文冀，王明华，钟立强，秦钦，王江，
申请(专利权)人：江苏省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32