单基因遗传性肾脏病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种单基因遗传性肾脏病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包含多种遗传性肾脏病相关致病基因或疾病易感基因中全部外显子序列的特异性寡核苷酸捕获探针。本发明专利技术提供的单基因遗传性肾脏病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法，先是构建受检者的全基因组DNA文库，然后利用制备的单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒捕获靶基因序列，再通过高通量测序平台的双端150bp测序模式对样本进行检测，生物信息学分析数据结果，从而能够快速、准确地找出与遗传性肾脏病相关基因的突变信息位点，以达到基因诊断的目的，且能够覆盖目前已知的所有遗传性肾脏病基因的外显子区域。

Gene screening method, kit and preparation method for single gene hereditary nephropathy

The invention discloses a method, a kit and a preparation method for joint screening of single gene hereditary kidney disease genes. The kit comprises a specific oligonucleotide capture probe for all exon sequences of various hereditary kidney disease related pathogenic genes or disease susceptibility genes. The method, kit and preparation method of the single gene hereditary kidney disease gene joint screening provided by the invention are as follows: firstly, the whole genome DNA Library of the examinee is constructed, then the target gene sequence is captured by the prepared single gene hereditary kidney disease gene screening kit, and then the sample is detected by the double-ended 150 BP sequencing mode of the high throughput sequencing platform, and the bioinformatics analysis number is obtained. According to the results, we can quickly and accurately identify the mutation information sites of genes related to hereditary kidney disease, in order to achieve the purpose of gene diagnosis, and can cover all the known exon regions of hereditary kidney disease genes.

【技术实现步骤摘要】
单基因遗传性肾脏病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种基因筛查方法、试剂盒及其制备方法，尤其涉及一种筛查各类遗传性肾脏病的试剂盒及其制备和使用方法。
技术介绍
慢性肾脏病(CKD)为突出的全球健康问题，流行病学研究显示我国CKD的发病率为10.8％，美国为13.1％。CKD如得不到有效控制，会发展为终末期肾功能衰竭(ESRD)，为患者、家庭和社会带来沉重的负担。单基因遗传性肾脏病是CKD的重要病因，比如常染色体显性多囊肾病(ADPKD)在成人尸体解剖中发病率为1:500，占ESRD的10％左右，是我国ESRD的第四位病因。薄基底膜病(TBMD)是另一种发病率很高的单基因遗传性肾脏病，由于该病的诊断依赖肾组织电子显微镜检查，所以大量病人被漏诊或误诊，有研究指出TBMD在普通人群中的发病率可以达到1％。单基因肾脏病的种类繁多，大多数缺乏特异性临床表现，诊断依赖基因检测、肾活检和特殊检查(比如TBMD需电子显微镜检查、Fabry病需要进行α-galA酶活性检测、Alport诊断亦依赖电子显微镜和IV型胶原不同a链在皮肤或肾组织染色等)，临床诊断困难，漏误诊率极高。世界卫生组织(WHO)指出21世纪的医学将从疾病医学向健康医学发展，从群体治疗向个体治疗发展。个体化医学(individualizedmedicine)为运用个体的基因组信息对疾病进行预防、诊断以及治疗的科学。相信随着肾脏病遗传学研究的不断深入，个体化医学终将彻底改变现有的诊疗模式。个体化医学的发展将通过影响肾脏病诊断(包括产前诊断)、风险评估、治疗、预测预后以及肾移植等几个方面改变现有诊疗模式。个体化医学的重要组成部分之一是基因诊断，用基因检测来诊断疾病已经在全球范围内掀起了一股产业巨浪，著名企业Google已经投资了几家基因测序的公司基金从事基因诊断的研究。基因检测也越来越被人民大众认知，越来越多的病人在了解自己的疾病的家族史时也会询问医生是否可以作基因检测。基因诊断对于符合孟德尔遗传规律的单基因肾脏病的诊断具有重要意义。特别当疾病临床表现不典型时，检测到致病突变可以帮助确诊。基因检测对于肾脏病诊断的重要性还在于可以应用于产前基因诊断。当了解妊娠女性所携带致病遗传变异后，可以通过对胎儿进行产前基因诊断，确定胎儿是否携带致病遗传变异，在分娩前评估其患病的可能性，使得早期干预成为可能。可见产前基因诊断对于优生优育具有重要作用。产前基因诊断需要获得胎儿的DNA，目前可以通过母血胎儿细胞、羊水穿刺、绒毛活检以及胎儿脐带血穿刺等手段获得，在获取胎儿DNA时要避免来自母体细胞的污染。产前基因诊断的关键在于正确定位该家系的致病基因突变，为达到此目的需要对临床表型、遗传方式进行准确的判断。目前能开展遗传性肾脏病产前诊断的单位还非常少，主要原因在于遗传检测的成本过高，且没有找到一个高效的模式，相信随着检测成本的降低以及对于遗传性肾脏病认识的提高，产前基因诊断总将成为可能。随着遗传学研究的不断开展和深入，近年来越来越多单基因遗传性肾脏病的致病基因被成功定位。虽然基因检测的概念已经大众化，并且在国际著名影星安吉丽娜朱莉在乳腺癌易感基因BRAC检测发现突变后进行乳腺癌切除的事件报道后基因检测已经是广大病患常常咨询医生的问题，但是在国际上肾脏病的诊断仍然缺乏有效而经济的解决方案。下一代测序技术NextGenerationSequencing是对传统测序的一次革命性的改变，能一次并行地对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。与传统测序技术相比较而言，下一代测序技术的显著优点是费用低，通量高，速度快，因此科学界开始越来越多地应用第二代测序技术来解决各种生物学问题和进行疾病治疗研究。其中一项重要的贡献是在于帮助和推进个性化医疗的发展。目前，二代测序的主要应用包括重头测序(DenovoSequencing)，全基因组重测序(WholeGenomeResequencing)，外显子组捕获测序(ExomeCaptureSequencing)，转录组测序(TranscriptomeSequencing)，小分子RNA测序(SmallRNASequencing)，病毒基因组测序(ViralDeepSequencing)，染色质免疫共沉淀测序(ChIPSequencing)等等。现有的测序平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer,AppliedBiosystemsSOLIDsystem和最新推出的IonTorrentILLUMINAHISEQ3000。本项目通过在测序平台ILLUMINAHISEQ3000上实现不同的测序方式(外显子捕获测序)，为肾脏疾病寻找致病的基因提供有力的支持。下一代技术在国内外已经被广泛用于临床(无创唐氏筛查)检测。该技术平台也以获美国的FDA认证。但是国内目前还没有规范化经过临床验证的对肾脏病的基因检测的诊断试剂。综上所述，遗传性肾脏病是一类临床较为常见、诊断困难、漏误诊率很高的疾病。就此类疾病而言近几年，随着第二代测序平台(Next-GenerationSequencing,NGS)的诞生和发展，可在10个小时内检测46亿个碱基序列。不仅极大地减少了测序时间，同时也极大地降低了成本。克服了Sanger测序在应用范围和应用成本上的不足，基于NGS的靶向基因测序(targetgenesequencing,TGS)、全基因外显子组测序(wholeexomesequencing,WES)和全基因组测序(wholegenomesequencing,WGS)，在肾脏单基因遗传病的基因诊断中已有应用。因此，设计一种涉及最多种类遗传性肾脏病、包含最全面的致病基因的检测试剂盒，并且能结合第二代测序技术，高效低成本地筛查遗传性肾脏疾病，实现对患者、致病基因携带者及高危产儿等对象的早期筛查，可在基因表达水平上确诊和预测疾病，对早期治疗、干预措施提供指导意见。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种单基因遗传性肾脏病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法，能够快速、准确地找出与遗传性肾脏病相关基因的突变信息位点，以达到基因诊断的目的，且能够覆盖目前已知的所有遗传性肾脏病基因的外显子区域。本专利技术为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其中，包含多种遗传性肾脏病相关致病基因或疾病易感基因中全部外显子序列的特异性寡核苷酸捕获探针。上述的单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其中，所述探针长度为50～105bp。上述的单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其中，所述探针以生物素标记。上述的单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其中，所述多种遗传性肾脏病相关致病基因或疾病易感基因共有如下706种：NPHS1SLC4A4KIF7C3HPS5WNT6ANOS1CPT1AMPDU1MRE11ANPHS2NEK8CEP41CFIBLOC1S6WNT10ACHD7CPT2DPM1STK11LAMB2GLIS2CSPP1CD96BLOC1S3WNT7APROKR2DMP1MPIEPCAMLAMA2INVSCEP104DHCR7HRASWNT11FGFR1ENPP1B4GALT1MLH1PL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其特征在于，包含多种遗传性肾脏病相关致病基因或疾病易感基因中全部外显子序列的特异性寡核苷酸捕获探针。

【技术特征摘要】
1.一种单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其特征在于，包含多种遗传性肾脏病相关致病基因或疾病易感基因中全部外显子序列的特异性寡核苷酸捕获探针。2.如权利要求1所述的单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其特征在于，所述探针长度为50～105bp。3.如权利要求1所述的单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其特征在于，所述探针以生物素标记。4.如权利要求1所述的单基因遗传性肾脏病基因筛查试剂盒，其特征在于，所述多种遗传性肾脏病相关致病基因或疾病易感基因共有如下706种：5.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1)根据人类基因组HG19序列，调取全部与遗传性肾脏病发生相关基因的外显子序列；S2)针对全部外显子序列非重复区域设计50～105bp长度的捕获探针，每个探针沿着基因位置挪动3～10bp，使得目标区域每个碱基被探针覆盖3～20次；S3)合成步骤S2)中的捕获探针，并以生物素标记。6.一种单基因遗传性肾脏病基因联合筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：S1)获取、检测受检者的全基因组DNA样本；S2)构建受检者全基因组文库；S3...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢静远，陈楠，熊玉宇，杨福兰，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，晶能医疗科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31