一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法，其在土壤样品中加入甲醇和磷酸缓冲液的混合液，振荡提取后经布氏漏斗减压抽滤，再用甲醇和磷酸缓冲液的混合液洗涤残渣两次，收集全部滤液转入烧杯中，在水浴锅上浓缩至近干后，用磷酸缓冲液定容，过微孔滤膜，得土壤样品待测溶液，再采用高效液相色谱仪紫外检测器测定，外标法定量。本发明专利技术的样品制备方法简单，所用有机试剂较少，方法的灵敏度、准确度和精密度符合农药残留分析的技术要求。本发明专利技术平均回收率79.74‑81.26％，相对标准偏差3.68‑7.03％，最低检出浓度为0.05mg/kg，具有操作简单，成本低，快速，灵敏度高，定性定量准确的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法
本专利技术涉及土壤中四霉素残留量检测，具体涉及一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法。
技术介绍
四霉素(Tetramycin)是一种新型农用抗生素，四霉素为不吸水链霉菌梧州亚种的发酵代谢产物，它包括A1、A2、B和C四个组分，其中A1和A2为大环内酯类的四烯抗生素；B为肽嘧啶核苷酸类抗生素；C为含氮杂环芳香族抗生素。四霉素具有内吸抑菌活性，阻止病菌侵入和扩展作用，是一种高效低毒的防治真菌病害的生物农药，其具有杀菌谱广，对鞭毛菌、子囊菌和半知菌亚门真菌等三大门类二十六种已知病原真菌均有极强的杀灭作用，适用各种作物的多种真菌、细菌病害的防治。目前在生产上主要应用于防治水稻及果树病害，防治效果较好。近几年随着植物细菌性病害的发病逐年加重及真、细菌混发的状况越来越多，四霉素的防治优势更加突出，四霉素防治细菌性病害的活性高，同时对真、细菌病害都有防效，四霉素与其他农药的混配性非常强，因此，四霉素的应用越来越广泛。土壤作为一个复杂的多介质体系，是农药的一个重要归宿场所。农药不论以何种方式使用，都会直接或间接地进入土壤中，土壤成为农药的蓄积库和耗散地。随着四霉素的应用，其残留在土壤中可能会威胁到生态平衡，为了研究四霉素在土壤中环境行为，稳定性及残留降解规律，首先必须建立土壤中四霉素残留的检测方法。目前，国内外未见四霉素在任何基质样品中残留量的检测方法报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法，其具有简单、准确、快速、可靠、成本低和易于掌握普及的特点，为土壤中四霉素残留量分析提供了一种快速可靠的方法。本专利技术提供的一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法,其包括下列步骤：步骤一：根据四霉素A1的性质选定高效液相色谱仪检测条件为：检测器采用紫外检测器；色谱柱为长度250mm×4.6mm，粒径5u的AgilentZorbax-C18色谱柱,柱温为35℃，流速为0.4mL/min，进样量为20uL，流动相为甲醇：质量浓度1％的甲酸水溶液，甲醇：1％甲酸水溶液的体积比为15：85，波长为292nm,保留时间13.5min；步骤二：样品预处理将采集土壤中的杂物去除，过20目筛，混匀后采用四分取样法留样200-300g，装入样品容器中，作为土壤样品；步骤三：四霉素A1的提取在步骤二得到的土壤样品中加入甲醇(V)：磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液，在35℃下振荡提取30min，之后经布氏漏斗减压抽滤，再用甲醇(V)：磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液洗涤残渣两次，收集全部滤液转入烧杯中，在80℃水浴锅上浓缩至近干后，用磷酸缓冲液定容至VmL，过0.45μm微孔滤膜，得土壤样品待测溶液；步骤四：残留量的计算运用步骤一中选定的高效液相色谱仪检测条件对步骤三得到的土壤样品待测溶液进行HPLC测定，记录色谱峰保留时间和色谱峰面积，通过色谱峰保留时间定性后，测得土壤样品待测溶液中四霉素A1的色谱峰面积A2，代入残留量计算公式，求得土壤样品待测溶液中四霉素A1的质量浓度X，即得土壤样品中四霉素A1的残留量，其中残留量计算公式如下：式中：X－土壤样品中四霉素A1的残留量，mg/kg；C－标准工作溶液中四霉素A1的浓度，mg/L；V－样品最终定容体积，mL；A1－标准工作溶液中的四霉素A1色谱峰面积；A2－样品待测溶液中的四霉素A1的色谱峰面积；m－样品质量，g。所述利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法还包括在步骤二之前确定步骤一选定的高效液相色谱仪检测条件是否能进行土壤样品的定性和定量分析：用色谱甲醇溶解并配制四霉素A1质量浓度为1000mg/L的标准母液，并采用梯度稀释法用pH7.4的磷酸缓冲盐稀释配制成0.05、0.1、0.50、1.00及5.00mg/L的标准工作溶液，在选定的高效液相色谱仪检测条件下进行测定，以四霉素A1的质量浓度x为横坐标、相应的色谱峰面积y为纵坐标绘制标准工作曲线，得出四霉素A1的标准工作方程为：y＝37.546x-0.7866，其相关系数R2＝0.9999，由此确定，步骤一选定的高效液相色谱仪检测条件能进行土壤样品的定性和定量分析。所述利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法还包括在确定步骤一选定的高效液相色谱仪检测条件能进行土壤样品的定性和定量分析之后进行添加回收实验，所述添加回收实验包括步骤为：1)将采集回来的没有施加四霉素制剂的空白土壤样品，除去土壤中的杂物，过20目筛，混匀后采用四分取样法留样200g，作为添加回收实验样品；2)准确称取已制备好的添加回收实验样品10.0g，置于250mL具塞三角瓶中，向添加回收实验样品中添加四霉素A1的标准工作溶液，使添加回收实验样品中四霉素A1的质量浓度分别为0.05、0.50和5.00mg/kg共3档浓度，同时做不含四霉素A1的空白对照处理，每档浓度的添加回收实验样品和空白样品都重复5次，然后每个样品中加入40mL甲醇(V)：pH7.4的磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液，在35℃下振荡提取30min，之后经布氏漏斗减压抽滤，再用30mL甲醇(V)：pH7.4的磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液分两次洗涤残渣，收集全部滤液转入烧杯中，在80℃水浴锅上浓缩至近干，用pH7.4的磷酸缓冲液定容至VmL，过0.45μm微孔滤膜，得添加回收实验样品待测溶液；3)运用步骤1)中选定的高效液相色谱仪检测条件对步骤2)得到的添加回收实验样品待测溶液进行HPLC测定，记录色谱峰保留时间和色谱峰面积，通过色谱峰保留时间定性后，测得添加回收实验样品待测溶液中四霉素A1的色谱峰面积A2，代入残留量计算公式，求得添加回收实验样品待测溶液的质量浓度X，即得添加回收实验样品中四霉素A1的残留量，其中残留量计算公式如下：式中：X－添加回收实验样品中四霉素A1的残留量，mg/kg；C－标准工作溶液中四霉素A1的浓度，mg/L；V－添加回收实验样品最终定容体积，mL；A1－标准工作溶液中的四霉素A1色谱峰面积；A2－添加回收实验样品待测溶液中的四霉素A1的色谱峰面积；m－添加回收实验样品的质量，g；经过步骤2)的样品制备后，以添加标准物质的添加回收实验样品中四霉素A1的残留量值与实际添加四霉素A1标准物质的量之比即为添加回收率，如下式所示:判断回收率是否达到70-110％，相对标准偏差是否为0-20％，四霉素A1的最小检出量是否为1.0×10-9g，最小检出浓度为0.05mg/kg，所述步骤二中线性方程的相关系数是否大于0.99，若五个指标皆达到标准，则进行实际土壤样品的检测。所述步骤二中土壤采集时，随机取点5～10个，用土钻采集地面以下0～15cm的土壤1～2kg，再除去土壤中的碎石、杂草和植物根茎类杂物。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究并建立了甲醇与pH7.4的磷酸缓冲液的混合液提取土壤中四霉素的样品制备方法和高效液相色谱-紫外检测器检测的方法，该方法样品制备方法简单，所用试剂较少，回收率符合农药残留准则要求，且该方法经过验证具有较好的重复性和实用性，方法的精密度、准确度和检出限均可满足四霉素在土壤中的残留分析要求。附图说明图1为四霉素A1的标准曲线图；图2为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法,其特征在于包括下列步骤：步骤一：根据四霉素A1的性质选定高效液相色谱仪检测条件为：检测器采用紫外检测器；色谱柱为长度250mm×4.6mm，粒径5u的Agilent Zorbax‑C18色谱柱,柱温为35℃，流速为0.4mL/min，进样量为20uL，流动相为甲醇：质量浓度1％的甲酸水溶液，甲醇：1％甲酸水溶液的体积比为15：85，波长为292nm,保留时间13.5min；步骤二：样品预处理将采集土壤中的杂物去除，过20目筛，混匀后采用四分取样法留样200‑300g，装入样品容器中，作为土壤样品；步骤三：四霉素A1的提取在步骤二得到的土壤样品中加入甲醇(V)：磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液，在35℃下振荡提取30min，之后经布氏漏斗减压抽滤，再用甲醇(V)：磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液洗涤残渣两次，收集全部滤液转入烧杯中，在80℃水浴锅上浓缩至近干后，用磷酸缓冲液定容为V mL，过0.45μm微孔滤膜，得土壤样品待测溶液；步骤四：残留量的计算运用步骤一中选定的高效液相色谱仪检测条件对步骤三得到的土壤样品待测溶液进行HPLC测定，记录色谱峰保留时间和色谱峰面积，通过色谱峰保留时间定性后，测得土壤样品待测溶液中四霉素A1的色谱峰面积A2，代入残留量计算公式，求得土壤样品待测溶液中四霉素A1的质量浓度X，即得土壤样品中四霉素A1的残留量，其中残留量计算公式如下：...

【技术特征摘要】
1.一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法,其特征在于包括下列步骤：步骤一：根据四霉素A1的性质选定高效液相色谱仪检测条件为：检测器采用紫外检测器；色谱柱为长度250mm×4.6mm，粒径5u的AgilentZorbax-C18色谱柱,柱温为35℃，流速为0.4mL/min，进样量为20uL，流动相为甲醇：质量浓度1％的甲酸水溶液，甲醇：1％甲酸水溶液的体积比为15：85，波长为292nm,保留时间13.5min；步骤二：样品预处理将采集土壤中的杂物去除，过20目筛，混匀后采用四分取样法留样200-300g，装入样品容器中，作为土壤样品；步骤三：四霉素A1的提取在步骤二得到的土壤样品中加入甲醇(V)：磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液，在35℃下振荡提取30min，之后经布氏漏斗减压抽滤，再用甲醇(V)：磷酸缓冲液(V)＝3:7的混合液洗涤残渣两次，收集全部滤液转入烧杯中，在80℃水浴锅上浓缩至近干后，用磷酸缓冲液定容为VmL，过0.45μm微孔滤膜，得土壤样品待测溶液；步骤四：残留量的计算运用步骤一中选定的高效液相色谱仪检测条件对步骤三得到的土壤样品待测溶液进行HPLC测定，记录色谱峰保留时间和色谱峰面积，通过色谱峰保留时间定性后，测得土壤样品待测溶液中四霉素A1的色谱峰面积A2，代入残留量计算公式，求得土壤样品待测溶液中四霉素A1的质量浓度X，即得土壤样品中四霉素A1的残留量，其中残留量计算公式如下：式中：X－土壤样品中四霉素A1的残留量，mg/kg；C－标准工作溶液中四霉素A1的浓度，mg/L；V－样品最终定容体积，mL；A1－标准工作溶液中的四霉素A1的色谱峰面积；A2－样品待测溶液中的四霉素A1的色谱峰面积；m－样品质量，g。2.根据权利要求1所述的一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法,其特征在于还包括在步骤二之前确定步骤一选定的高效液相色谱仪检测条件是否能进行土壤样品的定性和定量分析：用色谱甲醇溶解并配制四霉素A1质量浓度为1000mg/L的标准母液，并采用梯度稀释法用pH7.4的磷酸缓冲盐稀释配制成0.05、0.1、0.50、1.00及5.00mg/L的标准工作溶液，在选定的高效液相色谱仪检测条件下进行测定，以四霉素A1的质量浓度x为横坐标、相应的色谱峰面积y为纵坐标绘制标准工作曲线，得出四霉素A1的标准工作方程为：y＝37.546x-0.7866，其相关系数R2＝0.9999，由此确定，步骤一选定的高效液相色谱仪检测条件能进行土壤样品的定性和定量分析。3.根据权利要求2所述的一种利用高效液相色谱仪测定土壤中四霉素残留量的方法,其特征在于还包括在确定步骤一选定的高效液相色谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽华，蒋方舟，陈恒辉，龚道新，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43