在经修饰的酵母中生产甾醇制造技术

本发明专利技术涉及在经修饰的酵母细胞中生产甾醇混合物，其中通过修饰所述酵母中的甾醇酰基转移酶活性，所述混合物中存在的酵母甾醇的量被显著降低或消除。经修饰的酵母细胞可用于生产维生素D3或其衍生物和/或其代谢物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在经修饰的酵母中生产甾醇本专利技术涉及在经修饰的酵母细胞中生产甾醇混合物，其中通过修饰所述酵母中的甾醇酰基转移酶活性，所述混合物中存在的酵母甾醇的量被显著降低或消除。经修饰的酵母细胞可用于生产维生素D3或其衍生物和/或其代谢物。维生素D3(又名胆钙化醇或calciol)可以在哺乳动物的皮肤中从原维生素D3(又名7-脱氢胆甾醇或7-DHC)合成，原维生素D3是暴露于紫外光时胆甾醇生物合成的产物，其中7-DHC被光化学转变为原维生素D3，原维生素D3在体温下异构化为生物活性形式的维生素D3。在肝脏中，维生素D3被转变为无生物活性的25-羟基维生素D3(又名骨化二醇(calcidiol、calcifediol)、25-羟基胆钙化醇，25-OH-D3或HyD)，其是维生素D3的主要循环形式。进一步的羟基化发生在肾脏中。对于维生素D3的工业生产，化学合成和生物技术合成(原则上)都是可用的。化学合成始于从例如羊毛脂中分离的胆甾醇，胆甾醇被脱氢成7-DHC，然后进行紫外光照射和进一步的纯化/提取步骤，从而导致维生素D3。或者，经修饰的酵母菌株可被用于产生维生素D3前体，维生素D3前体可被分离并进一步转变为维生素D3。过量的甾醇(例如维生素D3前体，包括7-DHC)储存在细胞内细胞器(所谓的脂滴)中，并可从中被进一步分离。游离甾醇(包括维生素D3前体)与储存在脂滴中的甾醇(呈甾醇或甾醇酯形式)之间的平衡是通过几种蛋白质(特别是酶，包括甾醇酰基转移酶)的作用触发的。通常，酵母或其它真菌细胞不适合维生素D3生产，原因在于：首先，从乙酰CoA开始，酵母和其它真菌所产生的天然主要甾醇是麦角甾醇而非胆甾醇。通过在编码ERG5和ERG6的基因中引入双重敲除已避开了这一瓶颈，导致胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇以几乎相等的量产生，并且这种erg5erg6双重敲除菌株仅最少量产生麦角甾醇。然而，这导致了另一瓶颈：仅胆甾-5，7，24(25)-三烯醇能被用作维生素D3前体，而酵母甾醇不能被用作维生素D3前体。三烯醇是7-DHC的直接前体，7-DHC可用于维生素D3生产。其它甾醇通路中间体如酵母甾醇的积累对于这种生产过程没有帮助，并且会在许多方面(产率、下游加工等)对生产过程有负面影响。因此，持续进行的任务是生成适于生产维生素D3前体的宿主细胞，例如酵母细胞，即产生胆甾-5，7，24(25)-三烯醇的宿主细胞，其中胆甾-5，7，24(25)-三烯醇与酵母甾醇之间的平衡转向胆甾-5，7，24(25)-三烯醇，预计这还会导致由这种酵母菌株产生的维生素D3前体(例如7-DHC)的量增加，维生素D3前体被进一步转变为维生素D3和/或其衍生物或代谢物。特定的代谢物(也是本专利技术的焦点)是25-羟基维生素D3。出乎意料地，我们现在发现：通过下述方法，产胆甾醇的酵母细胞内总甾醇的组成可以显著改变，即产物比例可以转向胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和/或7-DHC，而非待储存在脂滴中的酵母甾醇：降低或消除此类酵母菌株中存在的某些甾醇酰基转移酶的活性，并任选地向此类酵母细胞中引入异源甾醇-O-酰基转移酶(HAT)。特别地，已发现：通过减少或消除产胆甾醇的酵母中甾醇酰基转移酶同种型Are2p的活性，酵母甾醇的量可被几乎消除(基于酵母甾醇的总量)，朝向胆甾-5，7，24(25)-三烯醇(作为甾醇化合物存在于脂滴中)强烈增加。在进一步操作之后，此类菌株可被用于生产维生素D3前体，例如7-DHC。因此，本专利技术涉及一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，并且其携带ARE2基因的修饰，使得内源性ARE2的活性被降低或消除，优选地被消除，所述酵母细胞能够或用于生产包含胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母产生的甾醇的总量，与具有ARE2活性的酵母细胞(例如其中内源性ARE2有活性)相比较，所述混合物中酵母甾醇的百分比为约10％或更低。当在甾醇生产方法中使用所述酵母细胞时，基于甾醇的总量，胆甾-5，7，24-三烯醇的百分比可以增加至约75％或更高，优选例如77％、80％、86％、87％、90％、95％。因此，基于甾醇的总量，由所述酵母产生的胆甾-5，7，24-三烯醇与酵母甾醇的比例在约≥7至约≤1的范围内。当使用其中ERG5和ERG6被失活且ARE1活性和ARE2活性(例如内源性ARE1和ARE2的活性)均被降低或消除、优选消除的酵母细胞时，该比例甚至更多地转向胆甾-5，7，24-三烯醇。在此类酵母细胞中，基于甾醇的总量，所述比例可以在约≥8至约≤10的范围内，甚至在约≥8至约2的范围内。当与具有ARE1活性和/或ARE2活性的酵母细胞(例如，其中内源性ARE1和ARE2仍然有活性)相比时，通过使ARE2失活，酵母甾醇的百分比减少约4倍。这在以下菌株中甚至更高，其中ARE2和ARE1都被失活，例如，其中内源性ARE2和ARE1被失活，即与具有ARE1和/或ARE2活性的酵母细胞(例如，其中内源性ARE1和ARE2仍然有活性)相比，百分比减少约20倍。在另一个实施方式中，本专利技术涉及一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中所述酵母细胞内的ARE2活性(例如，内源性ARE2的活性)被降低或消除，优选地被消除，所述酵母细胞能够或用于生产包含胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞内产生的甾醇的总量，所述混合物中胆甾-5，7，24-三烯醇的百分比约为至少75％，优选例如77％、80％、86％、87％、90％、95％。在一个特定的实施方式中，酵母细胞被进一步修饰，使得ARE2和ARE1的活性均被降低或消除，例如，内源性ARE2和ARE1的活性均被降低或消除，优选地被消除，这会导致胆甾-5，7，24-三烯醇的百分比进一步增加，即基于甾醇的总量，在约86％或更高的范围内。因此，与其中ERG5和ERG6被失活但其中ARE1和ARE2仍然有活性的产胆甾醇的酵母细胞相比，胆甾-5，7，24-三烯醇的量可以增加约2倍(在ARE2活性和ARE1活性被降低或消除、优选被消除的酵母细胞中，例如在其中内源性ARE1和ARE2的活性均被降低或消除、优选被消除的酵母细胞中)。本文所述实施方式的酵母细胞可用于生产维生素D3前体(例如，7-DHC)的方法中。因此，本专利技术涉及一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中所述酵母表达选自EC1.3.1.72的异源酶，特别是具有甾醇Δ24-还原酶活性的异源酶，优选脊椎动物酶，并且其中ARE2活性被降低或消除，优选地被消除，例如内源性ARE2的活性被降低或消除，优选地被消除，所述酵母能够或用于生产包含7-DHC和酵母甾醇的甾醇混合物，其中所述混合物中酵母甾醇的百分比在约2％或3％或更低的范围内。使用这种酵母菌株时，基于甾醇的总量，所述混合物中存在的7-DHC的百分比为约87％或更高，优选例如88％、90％、95％、98％。在一个特定的实施方式中，酵母细胞被进一步修饰，使得ARE2活性和ARE1活性均被降低或消除，优选地被消除，例如，内源性ARE2和ARE1的活性均被降低或消除，优选地被消除，这会导致7-DHC的百分比进一步增加，即基于甾醇的总量，在约90％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中甾醇酰基转移酶同种型ARE2活性已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾‑5,7,24(25)‑三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞产生的甾醇的总量，所述甾醇混合物中酵母甾醇的百分比为约10％或更低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.23 CH 01908/151.一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中甾醇酰基转移酶同种型ARE2活性已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5,7,24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞产生的甾醇的总量，所述甾醇混合物中酵母甾醇的百分比为约10％或更低。2.一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中内源性ARE2的活性已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5,7,24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞产生的甾醇的总量，胆甾-5,7,24(25)-三烯醇的百分比约为75％或更高。3.一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中ARE2活性已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5,7,24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中所述甾醇混合物中存在的胆甾-5,7,24(25)-三烯醇与酵母甾醇之间的比例在约7至约1的范围内。4.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达选自具有甾醇Δ24-还原酶活性的EC1.3.1.72的异源酶，优选地其中所述异源酶源自植物或脊椎动物，更优选地源自人类、猪、狗、小鼠、大鼠、马或斑马鱼。5.根据权利要求1至4中任一项所述的酵母细胞，其中ARE1活性已被...

【专利技术属性】
技术研发人员：汉斯彼得·霍曼，雷吉纳·莱伯，马丁·莱玛恩，科琳娜·奥达尔，芭芭拉·佩特斯查彻尔，哈拉德·皮希勒，比吉特·普罗尔，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL