具有α-半乳糖苷酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及使用具有α‑半乳糖苷酶活性的多肽从豆科作物中释放半乳糖的方法。本发明专利技术还涉及具有α‑半乳糖苷酶活性的多肽、编码这些多肽的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同5产生这些多肽的方法。本发明专利技术还涉及包含本发明专利技术多肽的组合物以及这些多肽在动物饲料中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有α-半乳糖苷酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸对序列表的引用本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。专利技术背景
本专利技术涉及使用具有α-半乳糖苷酶活性的多肽从豆科作物中释放半乳糖的方法。本专利技术还涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽、编码这些多肽的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生这些多肽的方法。本专利技术还涉及包含本专利技术多肽的组合物以及这些多肽在动物饲料中的用途。
技术介绍
α-半乳糖苷酶是一种糖苷水解酶，其从存在于豆科作物、蔬菜、谷粒、谷物等中的糖脂和糖蛋白的末端水解α-半乳糖基部分。α-半乳糖苷酶是通过各种微生物、植物和动物制备的，但哺乳动物缺乏肠道α-半乳糖苷酶产生，因此无法分解自己摄入的α-半乳糖苷。相反，摄入的α-半乳糖苷被肠道内存在的微生物分解。大豆是东亚特有的豆科作物，是全球第二大饲料作物，也是动物饲料中使用的最大的蛋白质来源。可以对大豆进行加工(脱脂)以产生大豆粉(SBM)，且SBM是一个重要且廉价的动物饲料优质蛋白质来源。其他常见的豆科作物有鹰嘴豆、羽扇豆、小扁豆、花生、豆类或豌豆，也可加工并用作动物饲料。豆科作物，例如大豆，含有大量的棉子糖寡糖，其需要α-半乳糖苷酶存在以释放半乳糖。高达70％的农民开支来自动物饲料的成本。因此，农民总是有兴趣通过减少饲养来降低饲料成本，或者通过使用相同数量的饲料来改进动物生长。实现这一目标的一种方法是通过使用酶，例如α-半乳糖苷酶，从饲料中释放尽可能多的能量。然而，酶也是一项费用，因此α-半乳糖苷酶应该在成本有效的剂量下起效。GH36α-半乳糖苷酶是现有技术中已知，例如披露于WO2009/108941(SEQIDNO:597，AXR38459)。然而，如实例13所示，与现有技术α-半乳糖苷酶接近的类似物在从大豆粉中释放半乳糖方面不是很有效。因此，本专利技术的目的是提供α-半乳糖苷酶，其比已知的α-半乳糖苷酶更有效地从豆科作物释放半乳糖。
技术实现思路
本专利技术涉及一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：(a)与SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14和SEQIDNO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(b)多肽的变体，该选自由以下组成的组：SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14和SEQIDNO:19，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包含在1至50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；(c)多肽，该多肽包含(a)或(b)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；(d)多肽，该多肽包含(a)或(b)的多肽以及多至10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；和(e)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度。本专利技术还涉及如权利要求中定义的分离的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，编码本专利技术的多肽的多核苷酸；核酸构建体；表达载体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及制备这些多肽的方法。本专利技术还涉及包含本专利技术的多肽的组合物(例如颗粒、液体配制品、动物饲料或动物饲料添加剂)及其用途；改进动物性能的方法；制备动物饲料的方法和用于改进动物饲料的营养价值的方法；序列表概述SEQIDNO:1是如分离自脱支芽孢杆菌的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。SEQIDNO:2是如从SEQIDNO:1推导的氨基酸序列。SEQIDNO:3是具有His-标签的SEQIDNO:2的氨基酸序列。SEQIDNO:4是如分离自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。SEQIDNO:5是如从SEQIDNO:4推导的氨基酸序列。SEQIDNO:6是具有His-标签的SEQIDNO:5的氨基酸序列。SEQIDNO:7是如分离自Anoxybacillusbogrovensis的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。SEQIDNO:8是如从SEQIDNO:7推导的氨基酸序列。SEQIDNO:9是具有His-标签的SEQIDNO:8的氨基酸序列。SEQIDNO:10是如分离自聚多曲霉的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。SEQIDNO:11是如从SEQIDNO:10推导的氨基酸序列。SEQIDNO:12是来自聚多曲霉的成熟GH36α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。SEQIDNO:13是如分离自芽孢杆菌属物种-19140的GH36α-半乳糖苷酶的cDNA序列。SEQIDNO:14是如从SEQIDNO:10推导的氨基酸序列。SEQIDNO:15是具有His-标签的SEQIDNO:14的氨基酸序列。SEQIDNO:16是如WO1994/23022中披露的α-半乳糖苷酶的校正的氨基酸序列。SEQIDNO:17是如分离自红紫曲霉(Aspergilluspuniceus)的GH36α-半乳糖苷酶的cDNA序列。SEQIDNO:18是如从SEQIDNO:17推导的氨基酸序列。SEQIDNO:19是来自红紫曲霉(Aspergilluspuniceus)的成熟GH36α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。SEQIDNO:20是来自Parageobacillusthermoglucosidans的成熟GH36α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。定义等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。α-半乳糖苷酶：术语“α-半乳糖苷酶”，也称为α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(E.C.3.2.1.22)，意指可以催化α-D-半乳糖苷(例如半乳糖寡糖、半乳糖甘露聚糖和半乳糖脂)中末端非还原性α-D-半乳糖残基水解的酶。可以使用4-硝基苯基α-D-半乳吡喃糖苷(可从麦格酶国际有限公司(MegazymeInternational)，布雷，威克洛郡，爱尔兰(Bray,Co.Wicklow,Ireland)获得)作为底物在室温下在100mMMES(西格玛公司)缓冲液pH7.0±0.05确定α-半乳糖苷酶活性。将酶稀释于2-倍稀释液并将4-硝基苯基α-D-半乳吡喃糖苷底物溶解于含有酶的溶液中。α-半乳糖苷酶活性在缓冲液中通过测量作为时间的函数在405nm时释放的pNP的吸光度直接进行跟踪。详细的测定可在本文所述的α-半乳糖苷酶测定中找到。在一个方面中，本专利技术的多肽具有SEQIDNO:12的多肽的至少60％、例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的α-半乳糖苷酶活性。动物：术语“动物”是指除人类以外的所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和牛犊)、鹿、yank、骆驼、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α‑半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中该具有α‑半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(g)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19，其中该变体具有α‑半乳糖苷酶活性并包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；(h)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽以及N‑末端和/或C‑末端His‑标签和/或HQ‑标签；(i)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽以及多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N‑末端和/或C‑末端延伸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽的片段，该片段具有α‑半乳糖苷酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.24 EP 16170960.51.一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：(a)与SEQIDNO:2的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(b)与SEQIDNO:5的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(c)与SEQIDNO:8的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(d)与SEQIDNO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(e)与SEQIDNO:14的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(f)与SEQIDNO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(g)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQIDNO:2、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14和SEQIDNO:19，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；(h)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；(i)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽以及多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度。2.根据权利要求1所述的方法，其中该GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)或获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)。3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中该GH36多肽包含或由如下组成：SEQIDNO:2的氨基酸1至728、SEQIDNO:3的氨基酸1至734、SEQIDNO:5的氨基酸1至731、SEQIDNO:6的氨基酸1至737、SEQIDNO:8的氨基酸1至732、SEQIDNO:9的氨基酸1至738、SEQIDNO:11的氨基酸1至719、SEQIDNO:12的氨基酸1至719、SEQIDNO:14的氨基酸1至731、SEQIDNO:15的氨基酸1至737、SEQIDNO:18的氨基酸1至735、或SEQIDNO:19的氨基酸1至735。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、胡豆(蚕豆)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中当在如下反应条件下进行时，该GH36多肽释放至少19g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉于10％w/v0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。6.一种分离的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：(a)多肽，该多肽与SEQIDNO:2的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(b)多肽，该多肽与SEQIDNO:5的多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(c)多肽，该多肽与SEQIDNO:8的多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(d)多肽，该多肽与SEQIDNO:12的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(e)多肽，该多肽与SEQIDNO:14的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(f)多肽，该多肽与SEQIDNO:19的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(g)多肽，该多肽由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码；(h)多肽，该多肽由与SEQIDNO:4的成熟多肽编码序列具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码；(i)多肽，该多肽由与SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码；(j)由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQIDNO:12的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(k)由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQIDNO:14的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(l)由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQIDNO:19的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；(m)SEQIDNO:2的变体，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·卡斯滕森，N·斯波茨博格，M·耶蒙森，J·萨洛蒙，K·B·R·M·克罗，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK