多能干细胞的传代方法技术

本公开提供一种适合大量培養的多能干细胞的传代方法。多能干细胞的传代方法包括如下工序：培养工序，培养多能干细胞来得到细胞块；以及分割工序，将细胞块以15cm/sec以上且150cm/sec以下的速度通过具有每个开口尺寸为30μm以上且80μm以下的多个通孔的筛网状膜，由此分割细胞块。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多能干细胞的传代方法
本公开涉及一种多能干细胞的传代方法。
技术介绍
作为与多能干细胞的传代方法相关的技术，例如已知有以下技术。例如，国际公开第2013/077423号中记载有将平均直径为约200μm～约300μm的均匀尺寸的多能干细胞的细胞块通过筛网并进行分割的传代方法。并且，国际公开第2013/077423号中记载有将筛网的孔径设为50μm左右，并将分割后的细胞块的直径设为约80μm～约120μm。并且，国际公开第2014/136581号中记载有将含有通过传代用过滤器部的筛网的多能干细胞的液体流速设为每分钟90mL～300mL。
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题例如，为了通过细胞移植来治疗肝病或心脏疾病等，认为一名患者需要1×109个以上的分化细胞的移植。为了实现该需要，开发出大量培养多能干细胞的技术是不可或缺的。例如，在多能干细胞的培养中，如果通过细胞的培养产生的细胞块(球体)的尺寸过大，则细胞块彼此会粘接融合，从而会产生细胞开始分化或者细胞块中心部分的细胞坏死这样的问题。因此，为了防止细胞块的尺寸变得过大，必需在细胞培养期间中的适当的时期进行分割细胞块的分割处理。如上述国际公开第2013/077423号和国际公开第2014/136581号中的记载，与基于现有酶处理的传代方法相比，根据将生长到规定尺寸的细胞块通过筛网并进行分割的传代方法，能够实现提高传代后的细胞的生存率。但是，例如当要实现100升规模的大量培养时，如国际公开第2014/136581号中的记载，在将含有通过筛网的多能干细胞的液体的流速设为每分钟90mL～300mL时，处理需要大量时间，很难保持细胞的均质性。另一方面，对于增加和减小含有通过筛网的多能干细胞的液体的流速这两种情况，均需要考虑对多能干细胞损伤。本公开提供一种适合大量培養的多能干细胞的传代方法。用于解决技术课题的手段本公开所涉及的第1方案为多能干细胞的传代方法，其包括如下工序：培养工序，培养多能干细胞来得到细胞块；以及分割工序，将细胞块以15cm/sec以上且150cm/sec以下的速度通过具有每个开口尺寸为30μm以上且80μm以下的多个通孔的筛网状膜，由此分割细胞块。可以在培养工序中，在含有高分子化合物的培养液中培养多能干细胞。优选在分割工序中，将分割后的细胞块的当量圆直径的平均值设为30μm以上且75μm以下。多能干细胞可以为ES细胞或iPS细胞。专利技术效果根据本公开的上述方案，能够提供适合大量培養的多能干细胞的传代方法。附图说明图1A是表示本公开的例示的实施方式所涉及的分割装置的结构的剖视图。图1B是表示本公开的例示的实施方式所涉及的筛网的结构的俯视图。图2A是表示刚分割之后的细胞块的状态的显微镜照片。图2B是表示分割后经过1小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。图2C是表示分割后经过2小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。图2D是表示分割后经过3小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。图2E是表示分割后经过4小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。图2F是表示分割后经过24小时之后的细胞块的状态的显微镜照片。图3是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置的结构的图。图4是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施培养开始处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。图5是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施培养基更换处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。图6是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施分割处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。图7是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养装置实施冷冻处理的情况下的细胞和培养基等的流程的图。图8是表示本公开的例示的实施方式所涉及的细胞培养程序中的处理的流程的流程图。图9是以通过速度100cm/s通过筛网(4)并传代后的球体像。图10是以通过速度180cm/s通过筛网(6)并传代后的球体像。图11是以通过速度15cm/s通过筛网(1)并传代后的球体像。具体实施方式以下，参考附图对本公开的例示的实施方式进行说明。另外，对于各附图中相同或等价的构成要件和部分标注相同的参考符号。本公开的例示的实施方式所涉及的多能干细胞的传代方法包括如下工序：培养工序，培养多能干细胞来得到细胞块；以及分割工序，将细胞块以15cm/sec以上且150cm/sec以下的速度通过具有每个开口尺寸为30μm以上且80μm以下的多个通孔的筛网状膜，由此分割细胞块。[多能干细胞]能够适用于本例示的实施方式的多能干细胞只要是具有能够保持未分化状态的同时生长的“自我复制能力”和能够分化为所有三个胚层系列的“多分化能力”的未分化细胞，则并没有特别限制。作为多能干细胞，例如可举出胚胎干细胞(embryonicstemcell；ES细胞)、诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell；iPS细胞)、胚胎生殖细胞(embryonicgermcell；EG细胞)、胚胎癌细胞(embryonalcarcinomacell；EC细胞)、多能成体祖细胞(multipotentadultprogenitorcell；MAP细胞)、成体多能干细胞(adultpluripotentstemcell；APS细胞)、Muse细胞(多系分化持续应激细胞(multi-lineagedifferentiatingstressenduringcell))等。作为适用于本例示的实施方式的多能干细胞，优选ES细胞和iPS细胞。成为多能干细胞的来源的动物并没有特别限制。作为哺乳动物，例如可举出人、猴子、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪等。成为多能干细胞的来源的动物(即供体)优选是与移植其多能干细胞或从其多能干细胞分化诱导的细胞的动物(即受体)相同物种的动物。多能干细胞的建立可以通过公知的任意方法来进行。关于多能干细胞是否维持未分化状态，可以通过公知的方法确认。例如可举出通过流式细胞术或免疫染色确认未分化标记的表达的方法、通过在免疫缺陷小鼠的皮下进行注射而确认畸胎瘤形成的方法等。[多能干细胞的培养]以下，对本公开的例示的实施方式所涉及的培养工序进行说明。在本例示的实施方式中，多能干细胞优选通过悬浮培养而生长。具体而言，在培养容器中，与培养基一同填充多能干细胞而进行悬浮培养，直到多能干细胞的细胞块的当量圆直径的平均值例如成为200μm～300μm。另外，当量圆直径是指将由所提取的细胞块的每条轮廓线划定的区域视作具有相同面积的圆时的圆的直径。通过将细胞块的当量圆直径的平均值设为300μm以下，能够抑制由于形成细胞分泌的细胞因子等的微小环境引起的分化诱导。并且，能够抑制在细胞块的中心部分产生的细胞的坏死，从而抑制生细胞回收率的降低。另一方面，通过将细胞块的当量圆直径的平均值设为200μm以上，能够使细胞的回收率成为一定值以上。另外，在培养工序中得到的细胞块的尺寸通过考虑分化诱导的抑制、细胞的坏死、细胞的回收率等而进行适当变更。适用于本例示的实施方式的培养基并没有特别限制，可举出在干细胞培养中使用的公知的所有培养基。具体而言，可举出DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium))、DMEM/F-12(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多能干细胞的传代方法，其包括如下工序：培养工序，培养多能干细胞来得到细胞块；以及分割工序，将所述细胞块以15cm/sec以上且150cm/sec以下的速度通过具有每个开口尺寸为30μm以上且80μm以下的多个通孔的筛网状膜，由此分割所述细胞块。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.06 JP 2016-0933001.一种多能干细胞的传代方法，其包括如下工序：培养工序，培养多能干细胞来得到细胞块；以及分割工序，将所述细胞块以15cm/sec以上且150cm/sec以下的速度通过具有每个开口尺寸为30μm以上且80μm以下的多个通孔的筛网状膜，由此分...

【专利技术属性】
技术研发人员：香川英章，后藤俊，小桥创一，中辻宪夫，饗庭一博，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP