基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统，所述系统包括Cas9突变体表达载体pHS‑BCR‑LW062‑cas9(全长8654bp)和sgRNA(指导序列)产生载体pHS‑BPR‑LC001(全长4893bp)。本发明专利技术所述基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统能够靶向敲除家蚕功能基因，并极大降低其脱靶率，至少降低50倍，甚至降低1500倍；所述系统极大地提高了基因敲除的精准率，且反应流程简单；本发明专利技术所述系统中的Cas9突变体表达载体pHS‑BCR‑LW062‑cas9引入家蚕核型多角体病毒的强启动子IE1和家蚕密码子优化的cas9D10A，使该酶的表达效率大大增加；本发明专利技术所述系统中的pHS‑BPR‑LC001，使用的家蚕的U6启动子，插入IIS型Bsa I酶切位点，可利用golden gate连接法快速构建sgRNA表达载体，大大节省了操作步骤。

Precise knockout system of silkworm gene based on RISPR/Cas9 double-incision enzyme technology and its application

The present invention discloses a precise gene knockout system for silkworm based on CRISPR/Cas9 double-incision enzyme technology, which includes Cas9 mutant expression vector pHS BCR LW062 cas9 (full length 8654bp) and sgRNA (guiding sequence) generation vector pHS BPR LC001 (full length 4893bp). The silkworm gene precise knockout system based on RISPR/Cas9 double-incision enzyme technology of the invention can target and knock out functional genes of silkworm, and greatly reduce the miss rate, at least 50 times, or even 1500 times; the system greatly improves the accuracy of gene knockout, and the reaction process is simple; the expression vector pHS_BCR_LW062_ca of the Cas9 mutant in the system of the invention is pHS_BCR_LW062_ca. S9 introduced strong promoter IE1 of silkworm nuclear polyhedrosis virus and cas9D10A of silkworm codon optimization, which greatly increased the expression efficiency of the enzyme; the pHS BPR LC001 of the system described in the present invention, the U6 promoter of silkworm used, inserted into the IIS Bsa I digestion site, can quickly construct sgRNA expression vector by golden gate connection method, greatly saving the operation steps.

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统及其应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种CRISPR/Cas9双切口酶技术，具体为基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统及其应用。
技术介绍
基因组编辑技术是一种在基因组水平对DNA序列进行改造的遗传操作技术，能够实现基因定点插入或缺失突变、基因敲除、多位点或多基因突变和片段删除等精确操作。CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑技术，是基于简单的核苷酸互补配对方式结合在基因组靶位点实现定点突变，其具有实验过程简单、耗时短和工作量小等优势，已成功应用于多种生物的基因组编辑；然而，CRSIPR/Cas9本身具有脱靶突变的倾向性，特异性相对较低。研究表明：gRNA与染色体间的错配多达5个时仍然能形成可检测到的插入或缺失，错配的可接受程度取决于gRNA序列、染色体靶序列及所使用的细胞系。野生型Cas9具有两个核酸酶结构域，突变其中一个使其转变为切口酶，该酶切割DNA形成单链断裂,不改变sgRNA结合特异性并仍能被转运到脱靶位点；设计两个gRNA,分别与染色体上的两条链结合，最终得到切割位点错开本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统，其特征在于，所述系统包括Cas9突变体表达载体pHS‑BCR‑LW062‑cas9和sgRNA产生载体pHS‑BPR‑LC001。

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统，其特征在于，所述系统包括Cas9突变体表达载体pHS-BCR-LW062-cas9和sgRNA产生载体pHS-BPR-LC001。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统，其特征在于，所述pHS-BCR-LW062-cas9载体的骨架载体为pZDonor载体。3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统，其特征在于，所述pZDonor载体上连有家蚕密码子优化的Cas9突变体cas9D10A全长CDS序列SEQIDNO.3，且两端加有核定位信号NLS。4.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统，其特征在于，所述pZDonor载体上，Cas9突变体cas9D10A所使用的启动子为BmNPV的启动子IE1，并整合选择标记EGFP基因序列。5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas9双切口酶技术的家蚕基因精准敲除系统，其特征在于，所述pZDonor载体上，EGFP与cas9D10A共用一...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈兴家，陈艳荣，朱娟，蒋涛，唐顺明，赵巧玲，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32