一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，以混糖为碳源，以树干毕赤酵母为发酵菌株，发酵制备出树干毕赤酵母单细胞蛋白和含有乙醇的发酵液，然后向发酵液中加入产朊假丝酵母，发酵制备出产朊假丝酵母单细胞蛋白。本发明专利技术采用乙醇为中间过渡碳源，双菌分步发酵生产单细胞蛋白，结果发现，双菌分步发酵能够较好解决混菌共发酵情况下两种菌体之间相互抑制的问题，与产朊假丝酵母和树干毕赤酵母单菌发酵相比，双菌分步发酵的粗蛋白生产速率提升较为明显，分别提高了102.72％和38.41％。

A Two-Bacteria Stepwise Fermentation Method for Single Cell Protein Production Using Ethanol as Transition Carbon Source

The invention discloses a method for producing single cell protein by two-bacterial step fermentation using ethanol as a transitional carbon source. Using mixed sugar as carbon source and Pichia trunk as fermentation strain, the single cell protein of Pichia trunk and the fermentation broth containing ethanol are prepared by fermentation, then Candida prion is added to the fermentation broth, and the single cell protein of Candida prion is produced by fermentation. The invention adopts ethanol as intermediate carbon source for transition, and produces single cell protein by two-bacterial step fermentation. The results show that the two-bacterial step fermentation can better solve the problem of mutual inhibition between the two bacteria under the condition of mixed fermentation. Compared with the single fermentation of Candida prion and Pichia truncatus, the crude protein production rate of two-bacterial step fermentation is obviously increased by 102, respectively. 72% and 38.41%.

【技术实现步骤摘要】
一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法
本专利技术涉及农业废弃物生物转化生产单细胞蛋白(饲料蛋白)和生产其它生物产品等
，具体涉及一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法。技术背景20世纪以来，随着科技不断发展，人类在享受科技所带来的便利的同时，也面临着种种考验。能源紧缺、气候变化和环境污染三大问题日益严重，其中能源问题尤为紧迫，如何开发利用可再生的新能源成为各国研究的重点之一。与此同时，在传统的饲料蛋白行业，原有的饲料产量也已满足不了养殖需求，并且原有饲料的生产消耗大量粮食，在能源短缺的背景下，单细胞蛋白饲料孕育而出。单细胞蛋白(SingleCellProtein，SCP)是指工厂化大规模培养的、作为人类食品和动物饲料的蛋白质来源的酵母、细菌、放线菌、霉菌、藻类和高等真菌等微生物的干细胞。目前，单细胞蛋白主要用于饲料工业，酵母菌是目前生产SCP的微生物类群中最受到关注的一类，也是应用于工业化生产最广泛的一类。酵母蛋白含量高达60％，含有多种氨基酸，维生素含量丰富。常见的酵母有啤酒酵母和假丝酵母。通过查阅饲料添加剂品种目录(2013版)，树干毕赤酵母和产朊假丝酵母可以作为单细胞蛋白生产菌株。
技术实现思路
专利技术目的：针对产朊假丝酵母以混糖(葡萄糖和木糖)为碳源发酵单细胞蛋白时，由于碳源分解代谢以及Crabtree效应的影响，产朊假丝酵母优先利用葡萄糖生成乙醇，其次利用自身所产生的乙醇，最后再利用木糖，导致碳源利用效率不高和发酵周期过长的问题，本专利技术的目的是提供一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，以此希望提高多种碳源情况下碳源的利用效率，提高单细胞蛋白的产量。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，以混糖为碳源，以树干毕赤酵母为发酵菌株，发酵制备出树干毕赤酵母单细胞蛋白和含有乙醇的发酵液，然后向发酵液中加入产朊假丝酵母，发酵制备出产朊假丝酵母单细胞蛋白。所述的以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，包括以下步骤：(1)向碳源为葡萄糖与木糖组成的混糖的发酵培养基中，接种活化后的树干毕赤酵母恒温摇床培养发酵24～36h；发酵液离心得到树干毕赤酵母菌体和含乙醇的上清液；(2)向步骤(1)中的上清液添加必要的营养元素，灭菌后接种活化后的产朊假丝酵母，恒温摇床培养发酵不少于60h；(3)收集全部过程中所产生的菌体，洗涤后干燥，获得单细胞蛋白。步骤(1)中，混糖中，葡萄糖浓度为40g/L，木糖浓度为10g/L。步骤(1)中，树干毕赤酵母活化36h并增殖一轮(24h)后接入发酵，接入树干毕赤酵母初始OD600值为10。步骤(1)中，树干毕赤酵母发酵24h后，离心得到的沉淀经洗涤、烘干后作为单细胞蛋白；而离心得到的含有乙醇的上清液用于产朊假丝酵母生产单细胞蛋白。步骤(2)中，产朊假丝酵母活化24h并增殖一轮(24h)后接入发酵，接入产朊假丝酵母初始OD600值为3.5。步骤(2)中，产朊假丝酵母发酵60h后结束发酵。有益效果：与现有技术相比，本专利技术以乙醇为过渡碳源双菌分步发酵产单细胞蛋白，首先利用树干毕赤酵母在混糖发酵时糖利用速率更快的特点，在较短时间内将葡萄糖和木糖转化成乙醇以及少量单细胞蛋白，再利用产朊假丝酵母发酵周期更短的特点，将乙醇转化成单细胞蛋白，从而减少了碳源的种类，减缓了碳源的分解代谢阻遏，提高了木糖的利用效率。其中，与产朊假丝酵母和树干毕赤酵母单菌发酵的粗蛋白生产速率相比，双菌分步发酵的粗蛋白生产速率提升较为明显，分别提高了102.72％和38.41％，为单细胞蛋白高效生产提供了一个新思路。附图说明图1是两种酵母分别单菌发酵产单细胞蛋白结果图；图2是双菌分步发酵产单细胞蛋白(第一阶段树干毕赤酵母发酵24h)结果图；图3是双菌分步发酵产单细胞蛋白(第一阶段树干毕赤酵母发酵30h)结果图；图4是双菌分步发酵产单细胞蛋白(第一阶段树干毕赤酵母发酵36h)结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。以下实施例中，使用的主要培养基和测定方法如下：树干毕赤酵母活化及增殖培养基：木糖30g/L、鱼粉蛋白胨5g/L、酵母浸膏3g/L。树干毕赤酵母发酵培养基：碳源为混糖50g/L(葡萄糖和木糖分别为40g/L和10g/L)；氮源和无机盐为(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、EDTA2Na0.03g/L、ZnSO4·7H2O0.009g/L、MnCl2·2H2O0.002g/L、CoCl2·6H2O0.0006g/L、CuSO4·5H2O0.0006g/L、Na2MoO4·H2O0.0008g/L、CaCl2·2H2O0.009g/L、FeSO4·7H2O0.006g/L、H3BO30.002g/L、KI0.002g/L；pH6.0。产朊假丝酵母活化及增殖培养基：葡萄糖20g/L、鱼粉蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L。产朊假丝酵母发酵培养基：碳源为混糖50g/L(葡萄糖和木糖分别为40g/L和10g/L)；氮源和无机盐为酵母浸膏0.5g/L、KH2PO45g/L、(NH4)2SO45g/L、MgSO40.5g/L、CaCl20.13g/L；pH7.0。比浊法测定酵母生长量：取0.5mL发酵液于1.5mL离心管中，10000r/min离心5min后去上清液，沉淀中每次加入0.9％的生理盐水0.5mL洗涤3遍，最后将其溶于0.5mL的蒸馏水中，稀释适当倍数在600nm下用0.5cm光径的比色皿测定吸光度(吸光值维持在0.1～0.7)。所得吸光值A乘以稀释倍数即为OD600值。糖浓度的测定：葡萄糖浓度的测定采用高效液相色谱法。测定样品先经10000r/min离心5min，先稀释相应倍数，上清液经0.22μm的滤膜过滤后，在Agilent1260型高效液相色谱仪上，用Bio-RadHPX-87H柱(7.8×300mm)，0.005mol/L的硫酸作为流动相，流速为0.6mL/min，在色谱柱温为55℃，示差折光检测器(RI)上进行检测。将各种标准样品配制成一定浓度的混合标准母液，逐级稀释一定的倍数，建立浓度与吸收值之间的标准方程。菌体干重的测定：将离心收集后的菌体用蒸馏水重悬洗涤2次，离心3000r/min，5min。最后重悬的菌体倒入烧杯中，置105℃恒温烘箱烘干直至恒重，计算方法为：粗蛋白含量、粗脂肪含量的测定：分别采用凯氏定氮法(GB/T6432-94)测定粗蛋白含量和采用国标法测定粗脂肪含量(GB/T6433-2006)。平均粗蛋白生产速率的计算方法为：(7)单菌树干毕赤酵母发酵产单细胞蛋白采用挡板式锥形瓶和封口膜的形式。实施例1双菌分步发酵产单细胞蛋白，步骤如下：(1)以混糖为碳源，添加树干毕赤酵母发酵培养基中氮源和无机盐，灭菌后，接入树干毕赤酵母(PichiastipitisCBS5776)恒温摇床培养，30℃，150r/min，发酵24～36h；通气方式非挡板锥形瓶和棉花塞形式。发酵液离心得到菌体和含乙醇的上清液。离心得到的沉淀(菌体)经洗涤、烘干后作为单细胞蛋白；所产生的含有乙醇的上清液用于产朊假丝酵母生产单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，其特征在于，以混糖为碳源，以树干毕赤酵母为发酵菌株，发酵制备出树干毕赤酵母单细胞蛋白和含有乙醇的发酵液，然后向发酵液中加入产朊假丝酵母，发酵制备出产朊假丝酵母单细胞蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，其特征在于，以混糖为碳源，以树干毕赤酵母为发酵菌株，发酵制备出树干毕赤酵母单细胞蛋白和含有乙醇的发酵液，然后向发酵液中加入产朊假丝酵母，发酵制备出产朊假丝酵母单细胞蛋白。2.根据权利要求1所述的以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向碳源为葡萄糖与木糖组成的混糖的发酵培养基中，接种活化后的树干毕赤酵母恒温摇床培养发酵24～36h；发酵液离心得到树干毕赤酵母菌体和含乙醇的上清液；(2)向步骤(1)中的上清液中添加必要的营养元素，灭菌后接种活化后的产朊假丝酵母，恒温摇床培养发酵不少于60h；(3)收集全部过程中所产生的菌体，洗涤后干燥，获得单细胞蛋白。3.根据权利2所述的以乙醇为过渡碳源的双菌分步发酵产单细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，混糖中，葡萄糖浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱均均，伍陆，李欢，徐勇，李鑫，余世袁，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32