一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种25‑羟基维生素D3的抗体制备方法，包括人工抗原制备、动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的制备、饲养细胞的制备、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和亚克隆、25‑羟基维生素D3单克隆抗体纯化等步骤，由于25‑羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本发明专利技术将25‑羟基维生素D3偶联卵清白蛋白获得25‑羟基维生素D3人工抗原，所制备的25‑羟基维生素D3单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与25‑羟基维生素D3抗原结合力强等优点，可用于免疫荧光、酶联免疫或磁微粒免疫技术等来定性或定量检测人体中25‑羟基维生素D3表达水平，临床辅助预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症。

A preparation method of 25-hydroxyvitamin D3 antibody

The present invention discloses a preparation method of 25 hydroxyvitamin D3 antibody, including artificial antigen preparation, animal immunity and spleen cell preparation, myeloma cell preparation, feeder cell preparation, cell fusion, hybridoma cell screening and subcloning, 25 hydroxyvitamin D3 monoclonal antibody purification and other steps. Because the molecular weight of 25 hydroxyvitamin D3 itself is too small, there is no such step. The present invention has immunogenicity. The 25 hydroxyvitamin D3 conjugated ovalbumin obtains 25 hydroxyvitamin D3 artificial antigen. The prepared 25 hydroxyvitamin D3 monoclonal antibody has the advantages of high potency, good affinity and strong binding with 25 hydroxyvitamin D3 antigen. It can be used for qualitative or quantitative detection of human body by immunofluorescence, enzyme-linked immunosorbent assay or magnetic particle immunoassay. 25. Level of hydroxyvitamin D3 expression, clinical adjuvant prevention and treatment of rickets, osteomalacia and infantile tetany.

【技术实现步骤摘要】
一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法
本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法。
技术介绍
血清25羟基维生素D3是合成25-OH-VD3的前体，是维生素D的主要循环形式，其半寿期较长,血中浓度较稳定，可直接反映机体维生素D的水平，维生素D参与不但钙磷代谢的调节作用，近年来维生素D被证实具有更为广泛的生物学效应和免疫学效应，包括用以预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症，抑制多种类型细胞的增殖，诱导细胞调亡和分化，调节机体免疫系统的功能等。因此，血清中的25羟维生素D3已经成为健康体检的重要指标。现在有越来越多公司参与开发25羟维生素D3检测试剂盒，高品质的抗体，是开发25羟维生素D3检测试剂盒的关键技术和基础，但是当前的25羟维生素D3检测试剂盒，无论使用哪种技术，放射免疫法，胶体金，酶联免疫法，化学发光检测，磁微粒免疫技术，都不能得到与HPLC精确测试相媲美的结果，因此需进一步研发出一种25-羟基维生素D3单克隆抗体，可用于能够快速、准确检测25-羟基维生素D3的免疫检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种25-羟基维生素D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种25‑羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)25‑羟基维生素D3人工抗原制备：将25‑羟基维生素D3蛋白与N,N二甲基酰胺混合均匀后，加入三乙胺，混合均匀后，4℃反应，加入氯甲酸异丁酯，混匀4℃反应，得到活化的25‑羟基维生素D3蛋白；将OVA溶于超纯水中，通过氢氧化钠调整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均匀后，4℃反应，得到活化的卵清白蛋白；将活化的25‑羟基维生素D3蛋白与活化的卵清白蛋白混合4℃反应，反应完成后先用PBS缓冲液透析，重复2次，再用超纯水透析，重复2次，即得25‑羟基维生素D3人工抗原；(2)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠...

【技术特征摘要】
1.一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)25-羟基维生素D3人工抗原制备：将25-羟基维生素D3蛋白与N,N二甲基酰胺混合均匀后，加入三乙胺，混合均匀后，4℃反应，加入氯甲酸异丁酯，混匀4℃反应，得到活化的25-羟基维生素D3蛋白；将OVA溶于超纯水中，通过氢氧化钠调整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均匀后，4℃反应，得到活化的卵清白蛋白；将活化的25-羟基维生素D3蛋白与活化的卵清白蛋白混合4℃反应，反应完成后先用PBS缓冲液透析，重复2次，再用超纯水透析，重复2次，即得25-羟基维生素D3人工抗原；(2)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周进行抗原冲击，25-羟基维生素D3人工抗原尾静脉注射，3天后，取效价高小鼠的免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于培养液中；(3)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；(4)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，消毒后在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；(5)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞混合，放入融合管中，离心机离心，弃上清；将1mL50％PEG4000沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mLDMEM培养基，终止反应，离心机离心，弃上清，加入HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐静，田青青，陈星星，周义正，
申请(专利权)人：宁波奥丞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33