一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法及应用，构建的生物膜反应器以多孔隙的珍珠岩作为成膜载体，具有接触面积大价格低廉的优点，以新鲜的合成矿物盐培养基作为微生物的成膜环境；本发明专利技术利用单一特定的砷氧化效率极高的菌株构建了一个高效稳定的生物膜反应器，该生物膜反应器能够在5小时内完全将20mg/L As(III)氧化成As(V)，该氧化效率在之前所有单株生物膜反应器中是最高的；本发明专利技术为筛选生物膜反应器最佳的砷盐氧化细菌提供了新的方向，对环境中的砷污染问题的修复具有重要意义。

Construction and application of a biofilm reactor for acid-resistant arsenic-oxidizing bacteria community

The invention discloses a construction method and application of an acid-resistant arsenic-oxidizing bacterial community biofilm reactor, which uses porous perlite as a film-forming carrier, has the advantages of large contact area and low cost, and uses fresh synthetic mineral salt medium as the film-forming environment of microorganisms; the invention uses a single specific strain with high arsenic oxidation efficiency to construct the biofilm reactor. An efficient and stable biofilm reactor can completely oxidize 20mg/L As(III) to As(V) in 5 hours. The oxidation efficiency of the biofilm reactor is the highest in all previous single biofilm reactors. The present invention provides a new direction for screening the best arsenic salt oxidizing bacteria in the biofilm reactor and is of great significance for the remediation of arsenic pollution in the environment.

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法及应用
本专利技术属于高砷地下水修复
，具体涉及一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法及应用。
技术介绍
近年来，利用砷氧化微生物构建的生物反应器氧化去除砷污染水体中的砷受到了很大的关注，一些固定化的砷氧化微生物被应用到砷氧化膜生物反应器中。相关技术中，一种采用化能自养砷氧化菌构建的生物反应器能够在8小时内将200μg/LAs(III)几乎全部氧化，但不适合在酸性环境下使用。酸性矿井水会对矿业生产、生态环境等造成严重危害，当酸性矿井水未经处理直接排出，进入地表水体以后，会造成水质恶化，严重影响人民的饮水安全。在酸性环境中，砷氧化生物膜反应器的砷氧化的稳定性较差、氧化效率低。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的实施例提供了一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法及应用。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的技术方案是，一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法，包括以下步骤：(1)制备确定含有耐酸砷氧化细菌群落的混合菌液；(2)以珍珠岩颗粒作为成膜载体，填充于反应器中，反应器置于恒温器内，将上述混合菌液加入反应器至浸没所述珍珠岩颗粒，并通入氧气，搅拌至混合液与珍珠岩颗粒混合均匀；(3)向上述反应器中加入新鲜的MMM培养基，定期更换所述MMM培养基，耐酸砷氧化细菌群落在珍珠岩颗粒上形成生物膜；(4)向上述反应器中加入合成地下水，培养一定时间后耐酸砷氧化细菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反应器。优选地，所述步骤(1)中，通过适量酸性土壤在MMM培养基中振荡培养得到含有耐酸砷氧化细菌群落的混合菌液。优选地，所述步骤(2)中，珍珠岩颗粒的直径为0.2～0.4cm。本专利技术实施例还提供了上述方法构建的生物膜反应器的应用，应用于高砷地下水的修复。与相关技术比较，本专利技术提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术提供的生物膜反应器以多孔隙的珍珠岩作为成膜载体，具有接触面积大价格低廉的优点，以新鲜的合成矿物盐培养基作为微生物的成膜环境；本专利技术利用极端酸性环境下的砷氧化效率极高的菌株群落构建了一个高效稳定的生物膜反应器，该生物膜反应器能够在5小时内完全将20mg/LAs(III)氧化成As(V)。附图说明图1是本专利技术实施例生物膜反应器构建方法流程图；图2是本专利技术实施例制备的耐酸砷氧化细菌的氧化能力示意图；图3是本专利技术实施例构建生物膜反应器的装置示意图；图4是本专利技术实施例构建的生物膜反应器内微生物群落组成示意图；图5是本专利技术实施例制备的珍珠岩生物膜与干净的珍珠岩颗粒显微镜示意图；图6是本专利技术实施例构建的生物膜反应器修复高砷合成地下水的示意图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地描述。实施例一请参考图1，本专利技术的实施例提供了一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法，包括以下步骤：(1)制备确定含有耐酸砷氧化细菌群落的混合菌液；通过适量酸性土壤在MMM培养基中振荡培养得到的，所述混合菌液中富集耐酸砷氧化细菌；培养基的pH值为4.0±0.1；碳源来于牛奶和酵母提取物；(2)以珍珠岩颗粒作为成膜载体，填充于反应器中，反应器置于恒温器内，将上述混合菌液加入反应器至浸没所述珍珠岩颗粒，并通入氧气，搅拌至混合液与珍珠岩颗粒混合均匀；珍珠岩颗粒的直径为0.2～0.4cm；(3)向上述反应器中加入新鲜的MMM培养基，定期更换所述MMM培养基，耐酸砷氧化细菌群落在珍珠岩颗粒上形成生物膜；(4)向上述反应器中加入合成地下水，培养一定时间后耐酸砷氧化细菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反应器。本专利技术实施例还提供了上述方法构建的生物膜反应器的应用，应用于高砷地下水的修复。实施例二根据本专利技术的实施例一的方法构建一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器，包括以下步骤：(1)取5g石门酸性土壤加入到100mL的MMM培养基中30℃振荡培养得到富含耐酸砷氧化细菌的混合菌液；其中，培养基的pH值为4.0±0.1，砷浓度为5mmol/L；碳源来源于有机碳源10mmol/L的牛奶和0.02％酵母提取物；参照附图2，耐酸砷氧化细菌可将三价砷完全氧化为五价砷；(2)以珍珠岩颗粒作为成膜载体，填充于玻璃反应器中，反应器置于30℃恒温器内，将上述混合菌液加入反应器至浸没所述珍珠岩颗粒；参照附图3，从氧气瓶中以0.2MPa的压力向玻璃反应器内供氧，利用蠕动泵以60.0mL/min的流速搅拌玻璃反应器中的混合液，使其混合均匀；其中，玻璃反应器的直径为7cm，高为15cm，蠕动泵和氧气瓶之间采用直径为8mm的14#硅胶泵管连接；(3)向玻璃反应器中加入新鲜的MMM培养基，每隔一周更换新鲜的MMM培养基，持续三周，耐酸砷氧化细菌群落在珍珠岩上形成生物膜；同时，每周检测培养基中砷氧化的状况；所述MMM培养基，其成分为：3.0gKH2PO4、3.0gNa2HPO4、1.0gNH4Cl、0.3gMgSO4·7H2O、0.5gKCl、0.01gCaCl2、10.0ml维生素溶液、5.0ml微量元素溶液，加去离子水至1000.0ml，调节pH至7.0～7.2，所述MMM固体培养基通过在MMM培养基内加入1.5％琼脂得到；(4)向玻璃反应器中加入合成地下水，持续培养三周，使耐酸砷氧化细菌群落在生物膜上富集，即得到生物膜反应器；其中，合成地下水中的As(III)的浓度为20.0mg/L；合成地下水的成分为：9mg/LNH4Cl、6mg/LKNO3、3.16mg/LH3PO3、1.21mg/LSrCl26H2O、0.02mg/L(NH4)6MoO24·4H2O、18mg/LMnCl2·4H2O、277.5mg/LCaCl2、150mg/LMgSO4、7.8mmol/LNaHCO3、0.01mmol/LFeSO4·7H2O，用硫酸和氢氧化钠溶液调节pH值为4。其余同实施例一。参照附图4，本专利技术实施例制备的生物膜反应器中存在大量的微生物。实施例三采用电子显微镜观察本专利技术实施例一或二中珍珠岩上生物膜的形成，具体过程为：将1g干净的珍珠岩颗粒和从生物膜反应器中取出的1g含有生物膜的珍珠岩颗粒分别置于10mL离心管中，用0.1mol磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液(pH＝7.2)清洗三次；分别取出珍珠岩颗粒，放置于新的10mL离心管中，用2.5％戊二醛持续浸泡珍珠岩颗粒4h，使生物膜结构固定；从2.5％戊二醛溶液中分别取出珍珠岩颗粒，用0.1molPBS缓冲液(pH＝7.2)清洗3次，然后用1％锇酸浸泡珍珠岩颗粒2h，进行第二次固定；从锇酸溶液中分别取出珍珠岩颗粒，分别用浓度为50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇浸泡珍珠岩颗粒，梯度脱水；脱水后的珍珠岩颗粒，先用液氮冷冻，然后将珍珠岩颗粒置于冷冻干燥机中冻干4h；冻干后样品放置于金属托盘上，拿至真空镀膜仪中，喷金5min；将喷金完的样品置于电子显微镜下，调节显微镜工作距离至11mm，加速电压至20kV，放大倍数5000倍条件下观察珍珠岩样品。参照附图5，(a)为显微镜下从生物膜反应器中取出的珍珠岩颗粒的形态，(b)为显微镜下干净的珍珠岩颗粒的形态；表明本专利技术实施例的耐酸砷氧化细菌在珍珠岩颗粒上形成了比较完整的生物膜。实施例四将35本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备确定含有耐酸砷氧化细菌群落的混合菌液；(2)以珍珠岩颗粒作为成膜载体，填充于反应器中，反应器置于恒温器内，将上述混合菌液加入反应器至浸没所述珍珠岩颗粒，并通入氧气，搅拌至混合液与珍珠岩颗粒混合均匀；(3)向上述反应器中加入新鲜的MMM培养基，定期更换所述MMM培养基，耐酸砷氧化细菌群落在珍珠岩颗粒上形成生物膜；(4)向上述反应器中加入合成地下水，培养一定时间后耐酸砷氧化细菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反应器。

【技术特征摘要】
1.一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备确定含有耐酸砷氧化细菌群落的混合菌液；(2)以珍珠岩颗粒作为成膜载体，填充于反应器中，反应器置于恒温器内，将上述混合菌液加入反应器至浸没所述珍珠岩颗粒，并通入氧气，搅拌至混合液与珍珠岩颗粒混合均匀；(3)向上述反应器中加入新鲜的MMM培养基，定期更换所述MMM培养基，耐酸砷氧化细菌群落在珍珠岩颗粒上形成生物膜；(4)向上述反应器中加入合成地下水，培养一定时间后耐酸砷氧化细菌群落在生物膜上富集，得到生物膜反应器。2.根据权利要求1所述的一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法，其特征是，所述步骤(1)中，取适量酸性土壤在MMM培养基中振荡培养得到含有耐酸砷氧化细菌群落的混合菌液；培养基的pH值为4.0±0.1。3.根据权利要求1或2所述的一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法，其特征是，所述步骤(1)中，取5g石门酸性土壤加入到100mL的MMM培养基中30℃振荡培养得到富含耐酸砷氧化细菌的混合菌液。4.根据权利要求1所述的一种耐酸砷氧化细菌群落生物膜反应器的构建方法，其特征是，所述步骤(2)中，珍珠岩颗粒的直径为0.2～0.4cm。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪春，祝贤彬，何忠，
申请(专利权)人：中国地质大学武汉，
类型：发明
国别省市：湖北,42