一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法技术

本发明专利技术公开一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法，包括如下步骤：获取羔羊瘤胃组织；钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层；将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白；用胰蛋白酶继续消化，收集细胞；把收集到的细胞沉淀清洗，用完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；换瓶培养，定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。本发明专利技术对瘤胃上皮细胞分离培养进行改进，通过此法能有效获得活力高，贴壁早，生长快的瘤胃上皮细胞。普通消化分离方法所得的细胞接种后3～6d开始贴壁，8～10d完成铺层，而本发明专利技术的消化分离方法所得的细胞在2～3d开始贴壁，5～6d完成铺层。

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法
本专利技术涉及细胞分离培养领域，尤其是一种绵羊羔羊的瘤胃上皮细胞的分离培养方法。
技术介绍
现在细胞体外培养技术已成为现代生物学研究领域中应用最广泛的技术。细胞体外培养具有实时监控(监测时可定量评估细胞形态、结构和生命活动等)、研究条件可控性强(便于各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育及凋亡等影响的研究)、样本均一性高(便于单因子和多因子分析)、应用范围广泛及费用相对低等优点。瘤胃是反刍动物对饲料营养物质消化、吸收及能量代谢的重要场所。瘤胃上皮系统作为发挥瘤胃功能的主要部位之一，可对挥发性脂肪酸以及Ca2+的吸收产生影响，并对瘤胃的酸化起到预防作用，且对母畜的分娩期、泌乳早期健康、泌乳性能及产后恢复有直接影响。瘤胃上皮细胞在一定条件应用于体外分离和培养。王远孝等对离体瘤胃上皮细胞在瘤胃代谢的研究进行综述，得出离体瘤胃上皮细胞培养技术可以应用于研究瘤胃上皮组织形态和代谢过程。目前，在上皮细胞培养中普遍使用胰蛋白酶和胶原酶，Baldwin等应用系列胰酶消化方法，虽然成功分离出足够数量的活细胞但只能进行短期培养，在测定2h培养期内BHBA生成时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获取羔羊瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织，将瘤胃内容物冲洗干净；(2)钝性分离并清洗瘤胃组织；(3)将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，进行清洗；(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，每隔一段时间收集一次细胞悬液，将细胞悬液过滤后混合，离心收集细胞；(5)收集到的细胞沉淀清洗，完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；(6)换瓶培养以去除成纤维细胞；定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获取羔羊瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织，将瘤胃内容物冲洗干净；(2)钝性分离并清洗瘤胃组织；(3)将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，进行清洗；(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，每隔一段时间收集一次细胞悬液，将细胞悬液过滤后混合，离心收集细胞；(5)收集到的细胞沉淀清洗，完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；(6)换瓶培养以去除成纤维细胞；定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。2.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述瘤胃内容物先用灭菌的D-Hanks溶液冲洗干净，然后用含青链霉素的D-Hanks溶液各方向刷洗多次，直至溶液出现澄清为止。3.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)所述钝性分离为用分离工具将黏附的浆膜层和肌肉层分离，再用含青链霉素的D-Hanks溶液冲洗。4.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)所述将瘤胃组织裁剪后，用含青链霉素的D-Hanks溶液清洗，然后平铺在锥形瓶底部，再用添加三抗的胰蛋白酶和的乙二胺四乙酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军花，刘理想，毛胜勇，朱伟云，孙大明，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32